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Diagnóstico prenatal de enfermedades raras: Los albores de los métodos no invasivos
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El diagnóstico prenatal definitivo se basa actualmente en técnicas invasivas, pero eso puede estar cambiando
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El 28 de febrero de 2019, el mundo celebró el Día de las Enfermedades Raras para concienciar sobre más de 6.000 enfermedades que afectan a menos de 200.000 ciudadanos estadounidenses. (Eso es aproximadamente una de cada 1.640 personas.)
Los avances en el diagnóstico molecular están detectando más enfermedades raras a un coste más bajo que nunca. Para las familias con antecedentes de enfermedades genéticas o cuando se detectan anormalidades de novo por medio de exámenes, el diagnóstico prenatal les da a los futuros padres y médicos la información que necesitan para elegir la mejor atención prenatal y postnatal. El diagnóstico prenatal definitivo se basa en técnicas invasivas que conllevan un pequeño riesgo de aborto espontáneo. Sin embargo, están surgiendo técnicas no invasivas que pronto podrían sustituir a los métodos tradicionales
Métodos actuales de diagnóstico y cribado
Las pruebas diagnósticas confirman una enfermedad genética con una precisión cercana al 100 por ciento. Hasta hace muy poco, el diagnóstico prenatal definitivo sólo era posible a través de métodos invasivos como el muestreo de vellosidades coriónicas (MVC) o la amniocentesis (análisis del líquido amniótico), que causan abortos espontáneos en el 0,2 y el 0,1 por ciento de los embarazos, respectivamente. Los recientes avances en el análisis molecular están proporcionando ahora un repertorio de pruebas para detectar enfermedades raras a partir del ADN fetal
Las pruebas de detección, por otro lado, proporcionan una puntuación de riesgo para las anomalías congénitas e identifican los embarazos con una mayor probabilidad de padecer enfermedades (principalmente cromosómicas); por lo tanto, las pruebas de detección pueden indicar si se requieren pruebas diagnósticas más precisas
La ecografía es el método de cribado más común, aunque la precisión depende de la habilidad del ecografista. Los defectos físicos importantes o la aneuploidía pueden evaluarse utilizando este método, pero no las enfermedades monogénicas como la fibrosis quística
El cribado prenatal no invasivo (PNI) consiste en el análisis del ADN fetal libre de células (ADNfc) aislado de la sangre materna. Estos fragmentos de 150-180 pares de bases (pb) de trofoblastos placentarios constituyen entre el 4 y el 20 por ciento del ADN libre. Los falsos positivos y negativos ocurren debido a la baja fracción de cffDNA, el mosaicismo placentario, las anomalías genéticas maternas y los fetos múltiples, por lo que actualmente no se recomienda el uso de NIPS para el diagnóstico
Técnicas moleculares que avanzan en la detección de enfermedades raras no invasivas
Las mejoras en la PCR, el microarray, la secuenciación, el haplotipado y otros métodos moleculares están beneficiando tanto a la investigación de las enfermedades raras como a su detección mediante métodos no invasivos basados en el ADN cffDNA.
Los científicos han desarrollado recientemente la amplificación localizada para simplificar el haplotipado, haciéndola más práctica para el diagnóstico de la enfermedad monogénica hereditaria en los fetos. En otras áreas, las tecnologías de microarrays cromosómicos están revelando la patología de las microdeleciones y la microduplicación; por ejemplo, el PrenaTest de la empresa alemana LifeCodexx utiliza la PCR cuantitativa de cffDNA para detectar la microdeleción única del cromosoma 22 que conduce al síndrome DiGeorges. La deleción ocurre en uno de cada 3,000 nacimientos y puede causar dificultades de aprendizaje, defectos cardíacos e inmunodeficiencia.
La combinación de la secuenciación de próxima generación (NGS) con la bioinformática avanzada mejora la precisión del diagnóstico de cffDNA. Por ejemplo, la acondroplasia (un trastorno óseo que causa enanismo desproporcionado) y la displasia tanatofórica (un trastorno esquelético grave) se han confirmado con una precisión del 96,2 por ciento mediante la DGN
Los nuevos métodos de PCR también están conduciendo a un mejor diagnóstico prenatal no invasivo. El microchip Fluidigm, un método de PCR digital sensible que puede amplificar fragmentos individuales, puede diagnosticar la hemofilia y la anemia drepanocítica a partir del cffDNA. LifeCodexx reportó una mayor precisión, economía y velocidad para un NIPS usando PCR en tiempo real en comparación con NGS o microarray
Otros grupos de investigación se están centrando en aumentar el rendimiento de ADNcf de las muestras de sangre materna, mejorando así la fiabilidad de los NIDS. Cuando la fracción de cffDNA fue enriquecida usando selección de tamaño de gel de agarosa, los investigadores encontraron que el valor predictivo positivo, que indica la confiabilidad de una prueba de diagnóstico, mejoró en un seis por ciento en comparación con el NIDS estándar. Otras estrategias consisten en mejorar la estabilidad de la fracción fetal en los tubos de extracción de sangre para maximizar el ADNcf disponible para el análisis
Investigaciones recientes han descubierto más características que pueden aumentar aún más la especificidad de los NIPS, como la hipometilación de fragmentos de ADN cff. Sin embargo, no todas las mutaciones y anormalidades pueden ser detectadas usando NIPS; por ejemplo, el síndrome del cromosoma X frágil, que afecta las capacidades cognitivas, es causado por 1.000 repeticiones bp que no están contenidas en los fragmentos cortos de cffDNA.
Diagnóstico basado en células fetales
La presencia de células fetales intactas en la sangre materna se descubrió a finales de la década de 1960. Desde entonces, se ha intentado explotar estas células para el diagnóstico, ya que proporcionan genomas fetales enteros separados del ADN materno, en lugar de fragmentos. Desafortunadamente, estas células, la mayoría de las cuales son glóbulos rojos nucleados (nRBC), trofoblastos y leucocitos, son increíblemente escasas a aproximadamente una célula por mililitro de sangre. Esta rareza y la falta de marcadores celulares fetales específicos han retrasado la tecnología. La siguiente lista incluye sólo algunas de las investigaciones que se están llevando a cabo para desarrollar pruebas de diagnóstico de células fetales no invasivas viables:
Un método de diagnóstico basado en células fetales recientemente desarrollado emplea una combinación de lisis de glóbulos rojos, clasificación de células activadas por imanes (MACS), clasificación de células activadas por fluorescencia (FACS) y separación manual de células fetales. El MACS y el FACS se basan en anticuerpos monoclonales contra los marcadores de la superficie celular, pero la contaminación es un problema porque las células fetales y maternas comparten marcadores. Por lo tanto, este método implica la selección manual de células para separar las células fetales y maternas como su último paso; sin embargo, la selección manual de células puede ser demasiado laboriosa para el laboratorio de diagnóstico promedio.
Para superar el problema de la captura de anticuerpos inespecíficos, se ha desarrollado una técnica que utiliza la centrifugación por gradiente de densidad para iniciar la separación celular, seguida del aislamiento de eritroblastos a base de lectina, la tinción química de las células sanguíneas y la captura automatizada de imágenes y la microdisección por captura con láser (LCM). Esta técnica se ha utilizado con éxito para aislar los nRBCs
Los fundadores de Fetolumina Technologies Corp. esperan que sus microchips nanoVelcro para enriquecer los trofoblastos fetales a partir de la sangre materna conduzcan a un diagnóstico fiable y no invasivo. Los chips están impresos con anticuerpos para capturar trofoblastos. El etiquetado inmunocitoquímico distingue a los trofoblastos de los glóbulos blancos maternos para la MCV. No sólo se capturaron suficientes células usando estos chips, sino que la técnica de hibridación genómica comparativa de arreglos (aCGH) también diagnosticó con éxito la trisomía 13, 18 y X, y una deleción y duplicación cromosómica poco común.
Los científicos están desarrollando Cell Reveal™ - un chip microfluídico recubierto con anticuerpos marcadores celulares para nRBCs y trofoblastos. El sistema incluye un microscopio de fluorescencia equipado con un analizador de imagen automatizado que selecciona las células. La automatización completa de la técnica la hace más factible para el diagnóstico, siempre y cuando sea rentable. Debido a que Cell Reveal™ captura nRBCs así como trofoblastos derivados de la placenta, cualquier falso positivo causado por el mosaicismo placentario puede ser confirmado, aunque esto aún no ha sido demostrado.
La fundadora de Rarecells Diagnostics, Patrizia Paterlini-Bréchot, anunció el año pasado que la compañía desarrolló una prueba totalmente automatizada basada en células fetales que aísla las células por tamaño, no por anticuerpos, evitando así la captura de células maternas. El producto, llamado ISET, se ha reportado que recoge un promedio de 25-35 trofoblastos fetales de 10 mililitros de sangre
Los científicos han desarrollado recientemente la selección de células basada en capilares para separar los trofoblastos fetales enriquecidos y teñidos con anticuerpos contra los marcadores de la superficie celular. Usando la secuenciación del genoma completo y la aCGH, la prueba identifica con precisión la aneuploidía, las translocaciones, las eliminaciones y las duplicaciones. Arcedi Biotech lanzó el producto en la región central de Dinamarca en mayo de 2018 y su objetivo es crear una versión de gran volumen y totalmente automatizada.
4. Conclusiones
Las enfermedades raras, en su conjunto, afectan a 25-30 millones de personas en los EE.UU. Alrededor del 80 por ciento de las enfermedades raras tienen un origen genético, y la predisposición a una afección significa que los miembros de la familia a menudo están interesados en el diagnóstico prenatal. El diagnóstico ayuda a los médicos y a los padres a planificar el tratamiento y la atención, y en un puñado de casos, el tratamiento en el útero está disponible. Sin embargo, a veces las perspectivas de calidad de vida son tan pobres que la terminación es la mejor opción. En todos los casos, el diagnóstico precoz y preciso es la clave para obtener el mejor resultado posible
La implementación de diagnósticos de enfermedades raras dependerá de las iniciativas gubernamentales, así como de las empresas biotecnológicas y los laboratorios clínicos que anteponen la salud de las personas a los beneficios económicos. Los métodos NIPS en constante evolución, la aparición de pruebas basadas en células fetales y las nuevas formas de detectar anomalías genéticas raras significan que los futuros padres de todo el mundo podrían beneficiarse pronto de un diagnóstico prenatal no invasivo y preciso.