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Un nuevo método para obtener imágenes de muestras gruesas

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Elimine el desenfoque de la imagen sin pasar a confocal

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Contenido patrocinado: Los microscopios de fluorescencia de campo amplio (WF) proporcionan imágenes de alta resolución para muestras finas, pero su capacidad para obtener imágenes de muestras más gruesas es limitada debido a que la fluorescencia de fondo provoca imágenes borrosas. El seccionamiento óptico resuelve eficazmente este problema, pero tradicionalmente ha requerido un sistema confocal o un software de desenfoque. Ahora, con la tecnología de seccionamiento óptico en los escáneres de portaobjetos, los investigadores pueden beneficiarse de las capacidades confocales para obtener imágenes de muestras gruesas, con un rendimiento significativamente mejorado.

Limitaciones de la obtención de imágenes de campo amplio

La microscopía WF es una técnica de obtención de imágenes omnipresente que resulta muy eficaz para muestras finas (<10 µm). En la microscopía de campo amplio, la cámara recoge la luz de los planos enfocados y desenfocados, lo que no supone un problema para las muestras finas. Cuando se obtienen imágenes de muestras más gruesas, esta fluorescencia de fondo inevitable provoca imágenes borrosas y un contraste deficiente, oscureciendo las estructuras de interés. La microscopía confocal y otras técnicas de iluminación de barrido pueden resolver este problema. Funcionan conformando la iluminación en un patrón fijo, lo que da lugar a una imagen ópticamente seccionada. Estos sistemas pueden producir imágenes excelentes en condiciones favorables. Sin embargo, suponen un gasto considerable y dependen de la entrega de patrones de iluminación bien definidos y controlados en la muestra.

Un nuevo enfoque de la iluminación

Para anular los efectos de la fluorescencia de fondo sobre el contraste y la calidad de la imagen, no siempre es necesario disponer de patrones de iluminación bien definidos y controlados. Una técnica conocida como microscopía HILO utiliza patrones de moteado aleatorios para iluminar la muestra fluorescente. Los patrones de moteado presentan una intensidad granular con un alto contraste inherente, lo que hace que las imágenes de fluorescencia obtenidas mediante iluminación de moteado parezcan granulares. Esta granularidad proporciona contraste y una indicación directa del grado de enfoque de la muestra.

Durante la obtención de imágenes HILO, se recogen y procesan dos imágenes en bruto. La primera es una imagen WF normal con iluminación uniforme. A esta imagen se le aplica un filtro de paso alto para extraer la información de alta frecuencia, la parte "HI" de la microscopía HILO. Este paso elimina la información de baja frecuencia, incluida la información enfocada y desenfocada. La segunda imagen se captura utilizando iluminación de moteado para recuperar la información de baja frecuencia de la imagen enfocada, la parte "LO" de la microscopía HILO. Estas imágenes se procesan mediante un algoritmo que extrae la información enfocada y elimina la fluorescencia de fondo. A continuación, las dos imágenes se fusionan (Fig. 1) para obtener una imagen que contiene información de toda la gama de frecuencias, con la luz desenfocada eliminada.

El dispositivo de seccionamiento óptico SILA es una solución de obtención de imágenes de alto rendimiento para los escáneres de portaobjetos de investigación Slideview VS200 basados en microscopía HILO. Se trata de una tecnología complementaria para microscopios de campo amplio (WF) que elimina la luz desenfocada y produce un seccionamiento óptico nítido igual al de la microscopía confocal. El dispositivo SILA puede añadirse fácilmente a cualquier sistema VS200 y aporta ventajas a una amplia gama de aplicaciones que requieren la obtención de imágenes ópticas de alta calidad de muestras más gruesas.

Seccionamiento óptico ajustable

Dado que el dispositivo SILA procesa matemáticamente la imagen WF tradicional y la imagen de moteado, es posible ajustar el grado de seccionamiento óptico mediante un único parámetro, que denominamos espesor de seccionamiento (ST). Cuando el ST se ajusta a un valor alto, las imágenes muestran información de una mayor profundidad de campo, lo que da la apariencia de una imagen WF.

La figura 2 muestra una sección cerebral tomada con ST5. Con este valor alto de ST, quedan muchas zonas desenfocadas. A medida que se reduce el valor ST, la imagen muestra información de una profundidad de campo menor. Por lo tanto, al observar la sección cerebral tomada a ST2 y ST1, la información enfocada permanece mientras que los elementos desenfocados han desaparecido. La capacidad de optimizar el seccionamiento óptico de este modo permite la visualización a diferentes profundidades al tiempo que se elimina la fluorescencia de fondo. Esta característica del dispositivo SILA para el escáner VS200 es comparable a los sistemas de microscopía confocal, en los que cambiando el tamaño del estenopo se puede conseguir un efecto similar.

Capacidad de deconvolución

Antes del desarrollo del dispositivo SILA, los escáneres VS200 disponían de una solución alternativa para eliminar la luz desenfocada de las imágenes WF. Utilizando el software de deconvolución Trusight, es posible deconvolver imágenes utilizando algoritmos iterativos 2D restringidos (CI). Este enfoque basado en software funciona bien para eliminar parte de la luz desenfocada. Sin embargo, no elimina tanta luz desenfocada ni proporciona la optimización del seccionamiento óptico como la combinación de software y hardware utilizada en el módulo SILA. Sin embargo, la deconvolución proporciona una opción intermedia viable para visualizar muestras más finas en las que el seccionamiento óptico SILA no está disponible. En la figura 3 se muestran las diferencias de calidad de imagen entre la WF convencional, la deconvolución por software y las imágenes SILA.

Aplicaciones de las imágenes SILA

La tecnología de seccionamiento óptico SILA puede aportar un valor significativo a muchas aplicaciones de investigación, especialmente en la obtención de imágenes de capas celulares y muestras de tejido fijas y gruesas. Con funciones de optimización del seccionamiento, además de una eliminación del desenfoque y un contraste de imagen comparables a los de los microscopios confocales, SILA ofrece imágenes de alta calidad con un rendimiento muy superior.

La capacidad de obtener imágenes de muestras más gruesas es beneficiosa en la obtención de imágenes de neurociencia, donde a menudo se requieren secciones de tejido gruesas para preservar la morfología de la muestra. La obtención de imágenes de secciones cerebrales es un reto notorio. Es especialmente difícil debido a la propensión del tejido cerebral a producir un efecto de dispersión de la luz. Tradicionalmente, se requerían sistemas de microscopía confocal o de dos fotones para capturar una imagen de alta calidad y alto contraste, pero estos sistemas requerían una cantidad de tiempo considerable para obtener imágenes de un área tan grande como una sección cerebral. El escaneado automatizado de portaobjetos que ofrece el sistema VS200 con el dispositivo SILA agiliza enormemente la obtención de imágenes de muestras gruesas en un área extensa, proporcionando imágenes de alta calidad en una fracción del tiempo (figura 4).

La investigación de organoides es otra área que se beneficia de la obtención de imágenes SILA, ya que la obtención de imágenes de organoides presenta retos similares a los de la neurociencia. La obtención de imágenes de organoides es difícil debido al grosor de las muestras, mientras que es necesario obtener imágenes de grandes áreas para poder interrogar adecuadamente la morfología de los organoides. Como escáner de portaobjetos completos, el sistema VS200 con el módulo SILA puede proporcionar la cobertura necesaria para obtener imágenes de estas muestras de gran tamaño. Además, su procesamiento automatizado de imágenes, su función de dispersión puntual (PSF) independiente de la muestra y su sencillo flujo de trabajo permiten una rápida adquisición de imágenes. El dispositivo SILA también aporta valor a la investigación del cáncer, la biología espacial, la botánica, la embriología y muchos otros campos que requieren imágenes de alta calidad de muestras gruesas en grandes áreas.

Resumen

Las imágenes SILA pueden optimizar el seccionamiento óptico, reducir el desenfoque de las muestras y mejorar el contraste de las imágenes en comparación con los sofisticados microscopios confocales de barrido láser. El escáner de portaobjetos VS200 con el dispositivo SILA, que ofrece un rendimiento significativamente superior al de los sistemas confocales, permite obtener rápidamente imágenes de muestras grandes y tradicionalmente difíciles de obtener, lo que aporta importantes ventajas a la neurociencia, la investigación de organoides, etc.