Los métodos basados en la PCR conducen a los esfuerzos de diagnóstico de COVID-19

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En diciembre de 2019 se notificaron varios casos de neumonía atípica en la ciudad de Wuhan (China). Las pruebas de laboratorio confirmaron que el patógeno causante era un nuevo coronavirus, denominado provisionalmente 2019-nCoV y ahora llamado SARS-CoV-2. El SARS-CoV-2 causa la enfermedad oficialmente designada como COVID-19 por la Organización Mundial de la Salud (OMS). Al 27 de febrero de 2020, la OMS ha registrado 82.294 casos de COVID-19 en 46 países. De ellos, 78.630 se registraron en China y han provocado 2.747 muertes.

El 30 de enero de 2020, la OMS declaró el brote de COVID-19 como una emergencia de salud pública de interés internacional. Esta designación hace que un diagnóstico de laboratorio fiable sea crítico para los esfuerzos de intervención de la salud pública. "Nuestro objetivo es la detección temprana de nuevos casos y prevenir una mayor propagación del coronavirus", dijo el director de los Centros para el Control y la Prevención de Enfermedades (CDC) de los Estados Unidos, Robert R. Redfield, MD.

Con la propagación mundial del virus que amenaza una pandemia de COVID-19, la detección temprana puede impulsar el desarrollo de vacunas y drogas. Aquí, discutimos cómo las pruebas de diagnóstico para COVID-19 han evolucionado rápidamente desde los primeros casos hasta las últimas infecciones.

A principios de este año, los investigadores recogieron muestras de fluido broncoalveolar de los primeros pacientes y las analizaron para 22 virus y bacterias usando la reacción en cadena de la polimerasa (PCR). Las cepas de coronavirus previamente identificadas y otros patógenos conocidos por causar síntomas respiratorios no fueron detectados en las muestras. Esta fue la primera indicación de que el agente infeccioso era un nuevo patógeno no identificado previamente.

El equipo aisló entonces partículas de virus de los mismos pacientes y las examinó usando microscopía electrónica de transmisión. El virus mostró picos distintivos característicos de los coronavirus. Utilizaron la PCR de transcriptasa inversa (RT-PCR) para amplificar una región conservada de los betacoronavirus, lo que dio resultados positivos. Los betacoronavirus han estado implicados anteriormente en brotes de síndrome respiratorio agudo severo (SARS) y síndrome respiratorio de Oriente Medio (MERS).

Finalmente, los investigadores secuenciaron el genoma viral. Realizaron la alineación de la secuencia y el análisis filogenético del nuevo genoma del virus usando otros genomas de betacoronavirus (SARS-CoV y MERS-CoV) como referencia. Había menos del 90 por ciento de similitud en los dominios conservados del virus desconocido y de otros miembros de la familia del betacoronavirus. Así, los investigadores concluyeron que los síntomas respiratorios de los pacientes fueron causados por un nuevo virus betacoron

Durante las semanas siguientes a los primeros casos notificados, los investigadores de enfermedades infecciosas depositaron secuencias del genoma del SARS-CoV-2 en bases de datos abiertas como el GenBank y el GISAID. Esto impulsó a la comunidad internacional de científicos y profesionales de la medicina a desarrollar diagnósticos moleculares rápidos y fiables.

Los investigadores del Instituto de Virología de Berlín elaboraron ensayos para distinguir la infección por el SARS-CoV-2 del SARS-CoV basándose en la secuencia de nucleótidos del gen de la ARN polimerasa dependiente del ARN (RdRp). Validaron la reactividad cruzada del ensayo utilizando 297 muestras clínicas obtenidas de pacientes infectados con patógenos respiratorios conocidos. Un grupo separado de la Universidad de Hong Kong desarrolló un ensayo cuantitativo de RT-PCR de un solo paso para detectar dos regiones diferentes del marco de lectura abierto del gen del SARS-CoV-2 1b (ORF1b) y la región de la nucleocápside (N). Validaron la prueba en dos pacientes con sospecha de COVID-19. El ensayo del gen N fue unas 10 veces más sensible que el ensayo ORF1b en estas muestras clínicas. Los ensayos diseñados por ambos grupos se compartieron con la OMS y se enviaron para su uso en varios países.

En los Estados Unidos, los CDC desarrollaron un ensayo cualitativo de RT-PCR en tiempo real para detectar coronavirus similares al SARS e identificar específicamente el SARS-CoV-2. Los cebadores y las sondas se diseñaron contra la región nucleocápside del virus. Anteriormente, las muestras obtenidas de individuos con sospecha de COVID-19 tenían que ser enviadas al CDC para ser analizadas. Sin embargo, el 4 de febrero de 2020, la Administración de Alimentos y Medicamentos (FDA) emitió una autorización de uso de emergencia del Panel de Diagnóstico RT-PCR de los CDC. Ahora, la prueba puede ser enviada a los laboratorios de salud pública estatales y locales de EE.UU., a los laboratorios del Departamento de Defensa, y a laboratorios internacionales selectos. "Esta sigue siendo una situación en evolución y la capacidad de distribuir esta prueba de diagnóstico a laboratorios calificados es un paso crítico para proteger la salud pública", dijo el comisionado de la FDA Stephen M. Hahn, MD

Aunque la RT-PCR es una prueba muy sensible, puede sufrir algunos inconvenientes. Los cebadores de la RT-PCR generalmente están diseñados contra regiones conservadas del genoma viral del SARS-CoV-2. Los coronavirus tienen polimerasas de ARN dependientes del error, lo que hace que las mutaciones y los eventos de recombinación sean frecuentes. Las mutaciones en el SARS-CoV-2 son actualmente muy limitadas. Es necesario considerar cómo la especificidad y sensibilidad diagnóstica de los ensayos basados en la RT-PCR puede verse afectada si la tasa de mutación cambia

Las cargas virales bajas en pacientes asintomáticos o ligeramente sintomáticos pueden no ser detectadas con fiabilidad por la RT-PCR. Si bien los resultados positivos son indicativos de una infección activa por el SARS-CoV-2, no descartan una infección bacteriana o una coinfección con otros virus. Tanto los resultados positivos como los negativos deben interpretarse en combinación con los síntomas clínicos y los datos epidemiológicos

Algunos laboratorios estatales de salud pública han encontrado problemas al validar el ensayo RT-PCR del CDC de los Estados Unidos. Reportaron resultados positivos para los controles negativos del ensayo. Esto produce un resultado no concluyente que impide un diagnóstico clínico fiable. "...uno de los reactivos no funcionó de manera consistente... rehacer la fabricación es el siguiente paso", dijo en una teleconferencia la Dra. Nancy Messonnier, directora del Centro Nacional de Inmunización y Enfermedades Respiratorias de los CDC

Actualmente, los exámenes de diagnóstico se realizan en los fluidos respiratorios (aspirados nasofaríngeos, lavado broncoalveolar y esputo) y en el suero. Sin embargo, un estudio que utilizó cebadores para amplificar el gen de la espiga (S) del SARS-CoV-2 no pudo detectar de manera fiable el virus en los fluidos corporales no respiratorios como la sangre y la orina. Los CDC están trabajando para desarrollar un análisis de sangre que detectará los anticuerpos producidos contra el SARS-CoV-2. Esto ayudará a comprender mejor la transmisión de la enfermedad y a detectar la infección en personas con pocos o ningún síntoma.

La FDA de los Estados Unidos ha creado una plantilla de revisión de autorización de uso de emergencia que está disponible a petición de los desarrolladores de pruebas diagnósticas. Hasta la fecha, esta plantilla ha sido compartida con más de 50 desarrolladores que han expresado su interés en desarrollar diagnósticos para COVID-19