SARS-CoV-2 RapidPlex: Una plataforma de telemedicina multiplexada basada en gráficos para el diagnóstico y la supervisión rápidos y de bajo costo de COVID-19 by California Institute of TechnologyMedicalExpo

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Detecta la proteína nucleocápside del antígeno viral, los anticuerpos IgM e IgG, así como la proteína reactiva C del biomarcador inflamatorio, basado en nuestros electrodos de grafeno grabados con láser y de gran producción. Demostramos una detección electroquímica ultrasensible, altamente selectiva y rápida en los rangos fisiológicamente relevantes. Evaluamos con éxito la aplicabilidad de nuestra plataforma RapidPlex de SARS-CoV-2 con muestras de sangre y saliva COVID-19-positivas y COVID-19-negativas. Basándose en este estudio piloto, nuestra plataforma de inmunosensores multiplexados puede permitir la realización de pruebas de alta frecuencia en el hogar para el diagnóstico y la supervisión de la telemedicina con COVID-19.

El 11 de marzo de 2020, la Organización Mundial de la Salud caracterizó el brote de COVID-19 como una pandemia. Seis meses después, la crisis sanitaria mundial había continuado con más de 30 millones de casos confirmados de nuevos coronavirus en todo el mundo, de los cuales más del 22% se encontraban en los Estados Unidos.1 Se estima que entre el 14% y el 20% de los pacientes desarrollarán una enfermedad grave que requerirá hospitalización.2 Los esfuerzos iniciales para mitigar la propagación mediante órdenes de "permanencia en el hogar" impuestas por los estados parecían eficaces; sin embargo, la reapertura de la economía de los Estados Unidos dio lugar a una nueva propagación exponencial del nuevo coronavirus, tal como se predijo.3 Se estima que el producto interno bruto de los Estados Unidos sufrirá pérdidas de más de 45.300 millones de dólares durante una pandemia similar a la gripe si no se dispone de vacunas4 . La reapertura segura de la economía, las escuelas y las universidades requiere múltiples enfoques para mitigar los riesgos asociados a COVID-19, incluidas medidas de ensayo y rastreo sencillas, asequibles y eficaces.

Contener la propagación es difícil debido a las dificultades para identificar a los individuos infecciosos. La mayor parte de la propagación en la comunidad de COVID-19 puede ocurrir en ausencia de síntomas. La viremia máxima puede darse al final del período de incubación, lo que permite una carga viral suficiente para la transmisión 1-2 días antes de la aparición de los síntomas.3 Además, debido a la duración y prevalencia desconocidas de los casos asintomáticos, el número real de reproducción puede ser subestimado.5 , 6 La incidencia reportada de pacientes asintomáticos oscila entre el 17,9% y el 30,8%.7 , 8

El mayor acceso a las pruebas de COVID-19 ha permitido aumentar la vigilancia de la propagación en la comunidad, pero siguen existiendo varios problemas de diagnóstico. Actualmente, el método de prueba estándar es la PCR en tiempo real del ácido nucleico viral (RT-PCR), que es un proceso lento9 y requiere un equipo costoso y técnicos capacitados para la recolección y el análisis de muestras de hisopado nasofaríngeo9 . Además, el enorme volumen de pruebas que se requiere está abrumando la capacidad de los sistemas de atención de la salud para informar a los pacientes sobre los resultados de la RT-PCR, lo que causa, en algunos estados, demoras de ∼7 a 10 días para informar sobre los resultados positivos10 y promulgar protocolos de aislamiento y vigilancia. A pesar de los recientes avances en las pruebas rápidas de RT-PCR en los puntos de atención11, 12, 13, 14, 15, también se sabe que las pruebas de ácidos nucleicos producen falsos negativos, lo que puede limitar las estrategias de contención y el acceso al tratamiento16 . La identificación de las personas convalecientes sobre la base de la presentación de los anticuerpos contra el COVID-19 es igualmente importante, ya que puede proporcionar a los funcionarios de salud información crucial sobre las posibles repercusiones de las medidas de reapertura17 . Los ensayos serológicos detectan los anticuerpos circulantes específicos de los antígenos del SARS-CoV-2, incluidas la proteína de la nucleocápside y la proteína de la espiga externa9 , 18 . Por lo tanto, para mitigar eficazmente los riesgos de propagación en la comunidad del COVID-19, se necesitan sistemas que determinen simultáneamente el estado viral y serológico de un individuo. Además, estudios recientes muestran una correlación entre la concentración de biomarcadores inflamatorios circulantes y la gravedad de la COVID-1919 . El aumento de la concentración de proteína C reactiva (PCR) se encuentra en los pacientes diagnosticados con neumonía por COVID-19 y se asocia con el aumento de la gravedad, lo que sugiere un papel en el diagnóstico y el pronóstico de los pacientes con COVID-1920 , 21

Existe una clara y urgente necesidad de una prueba de COVID-19 de telemedicina de alta sensibilidad, rápida y económica que pueda identificar el estado de infección pasado y presente de un paciente22 . El análisis cuantitativo de los biomarcadores de COVID-19 mediante un dispositivo de telemedicina puede proporcionar información predictiva de la gravedad de la enfermedad y proporcionar información de seroconversión en relación con el curso temporal de la enfermedad. Los biosensores electroquímicos, a este respecto, son ventajosos debido a su rápida eficacia de detección y a su facilidad de uso para las aplicaciones de POC.23, 24, 25, 26, 27 La recogida de muestras de COVID-19, sencilla, segura y eficaz, ha resultado ser un reto dados los requisitos actuales de los ensayos. Los ensayos de POC compatibles con la saliva serían ventajosos, ya que la saliva contiene una gran cantidad de información y puede ser recogida fácilmente y de forma no invasiva por los propios pacientes para las pruebas de telemedicina28

Aquí, presentamos una novedosa plataforma electroquímica portátil e inalámbrica multiplexada para la detección ultrarrápida de COVID-19: SARS-CoV-2 RapidPlex (Figura 1 ). Esta plataforma detecta cuantitativamente los biomarcadores específicos de COVID-19 tanto en la sangre como en la saliva, incluyendo la proteína nucleocápside (NP) del SARS-CoV-2, inmunoglobulinas específicas (Igs) contra la proteína de punta (S1) del SARS-CoV-2 (S1-IgM y S1-IgG), y CRP, dentro de rangos fisiológicamente relevantes. La plataforma utiliza antígenos de captura y anticuerpos inmovilizados en electrodos de grafeno grabado por láser (LEG)29 , 30 de bajo costo y de producción masiva. Esta plataforma multiplexada rastrea la progresión de la infección mediante el diagnóstico de la etapa de la enfermedad, permitiendo la clara identificación de los individuos que son infecciosos, vulnerables y/o inmunes (Tabla 1 ). Las principales características del SARS-CoV-2 RapidPlex son la alta sensibilidad, el bajo costo, la detección ultrarrápida, la teledetección inalámbrica y la detección multiplexada que proporciona información sobre tres aspectos fundamentales de la enfermedad COVID-19: la infección vírica (NP)31 , la respuesta inmunitaria (IgG e IgM)9 y la gravedad de la enfermedad (CRP)19, 20, 21

Como se ilustra en la figura 1A, el SARS-CoV-2 RapidPlex está compuesto por cuatro electrodos de trabajo de grafeno (WEs), un electrodo de referencia de Ag/AgCl (RE) y un contraelectrodo de grafeno (CE), todos ellos con un patrón en un sustrato de poliimida (PI) a través de un grabado láser de CO2, un método de producción rápido, de alto rendimiento y rentable (figuras 1B y 1C). Nuestro grupo ha demostrado recientemente el uso de la estructura de grafeno mesoporoso fabricada por grabado láser para la biosensibilización de alto rendimiento y bajo costo29 , 30. El costo de los materiales para la plataforma RapidPlex no modificada está dentro de los 0,05 dólares; los costos adicionales de químicos y reactivos para la preparación del sensor multiplexado están al nivel de los dólares, dependiendo de los tamaños de los pedidos. La detección de las proteínas objetivo seleccionadas (NP y CRP) y las inmunoglobulinas específicas (S1-IgG y S1-IgM) se logra mediante estrategias de inmunosensibilización de base sándwich e indirecta en los electrodos de LEG, respectivamente. Las propiedades superiores del grafeno, en términos de alta movilidad de carga y superficie, junto con la alta sensibilidad y selectividad de las estrategias de detección que implican tanto receptores de captura como de detección, hacen que nuestro dispositivo (Figura 1D) sea una herramienta muy conveniente para la detección rápida, precisa y específica de la etapa de la infección por COVID-19 en la sangre, así como en muestras de biofluidos no invasivos, como la saliva.

Los pasos de funcionalización y modificación llevados a cabo en las superficies de la LEG para la fijación covalente de cada uno de los receptores específicos requeridos para el desarrollo de nuestra plataforma RapidPlex del SARS-CoV-2 se esquematiza en la figura 2 A. El ácido pirenobutírico (PBA) se utiliza como enlazador para anclar los receptores requeridos a la capa de grafeno. Aunque la fijación de grupos funcionales directamente en la superficie del átomo de carbono sp2 es una de las formas comunes de funcionalizar el grafeno, estos métodos se asocian con el requisito de defectos o bordes en el material del sensor, que podrían alterar sus propiedades físicas específicas32 En cambio, aquí se prefiere la introducción de grupos funcionales en la capa de sensores por medio de derivados del pireno, ya que no perturba la conjugación de las hojas de grafeno y mejora su estabilidad34 , 35 El PBA consistente en un grupo de pireno que contiene π-electrones y un grupo carboxílico se utiliza para funcionalizar las capas de grafeno mediante π-apilamiento e interacciones hidrofóbicas. Las unidades de pireno del PBA interactúan fuertemente con las capas de grafeno en la forma en que la estructura original y las propiedades del grafeno se mantienen bien. Las moieties funcionales contenidas en cada molécula de PBA permiten la preparación de la plataforma de biosensores basada en la afinidad a través del acoplamiento covalente entre los grupos carboxílicos de las unidades de PBA y los grupos -NH2 de los respectivos receptores de captura (anticuerpos específicos o proteínas de captura). El bloqueo de los sitios no reaccionados con la albúmina sérica bovina (ASB) impide la adsorción no específica de otras moléculas que participan en la configuración de cada ensayo o que circulan en la muestra de interés.

Las técnicas de voltamperometría diferencial de impulsos (DPV) y de espectroscopia de impedancia electroquímica de circuito abierto (OCP-EIS) se emplean para caracterizar y probar electroquímicamente los procesos autoensamblados por etapas en ambas configuraciones de ensayo para la detección de moléculas objetivo seleccionadas. Las lecturas de DPV reflejan una menor intensidad de corriente pico después de cada paso de modificación relacionado con el ensayo S1-Ig debido a la difusión obstaculizada de la etiqueta redox a la superficie del electrodo derivada tanto de los grupos carboxilos como de las proteínas y macromoléculas biológicas adheridas (Figura 2B). Al mismo tiempo, la resistencia en las parcelas de Nyquist de OCP-EIS aumenta después de cada paso de funcionalización (Figura 2C). El anclaje exitoso de PBA también se verificó con microscopía electrónica de barrido (MEB) (Figura S1). La caracterización electroquímica de la modificación del sensor basada en el ensayo en sándwich usando CRP como molécula modelo y las técnicas mencionadas anteriormente se presentan en la Figura S2.

Para preservar la estructura nativa y las propiedades de las biomoléculas unidas, elegimos el PBA como un enlazador heterobifuncional, evitando eficazmente la interacción directa entre las grandes biomoléculas y la superficie del grafeno.33 Para verificar esta selección, construimos configuraciones de ensayos de IgG específicas de CRP y SARS-CoV-2 en electrodos de grafeno funcionalizados con PBA y otro enlazador común, el ácido 1H-pirrol-1-propiónico (PPA).30 Se observaron mayores relaciones señal/blanco (S/B) en ambos ensayos en los que se utilizó PBA como soporte del enlazador (Figura 2D), principalmente debido a una disminución significativa de las señales obtenidas en ausencia de la correspondiente molécula objetivo cuando se utilizó PBA en lugar de PPA. Junto con una estrategia de bloqueo óptima, el PBA puede utilizarse para inmovilizar sondas biomoleculares específicas (por ejemplo, anticuerpos, proteínas), evitando al mismo tiempo las adsorciones no específicas en el contexto de los inmunoensayos36

La orientación de las proteínas antigénicas modificadas en las superficies sólidas está fuertemente asociada con su actividad y reactividad. Los anticuerpos específicos anti-His pueden utilizarse para orientar la inmovilización de los receptores antigénicos que contienen residuos de histidina, pero esto implica un paso adicional en comparación con su fijación directa en la capa de detección, como se esquematiza en la figura S3A. Nuestros resultados no muestran diferencias significativas en el rendimiento del ensayo para la detección de IgG en electrodos de grafeno PBA covalentemente funcionalizados con la proteína de revestimiento específica (inmovilización directa) y con anticuerpos anti-His para la captura previa de la proteína de revestimiento específica de la polistidina-Tag (inmovilización orientada) (Figura S3B), lo que demuestra que la orientación aleatoria de la proteína no interfiere con la accesibilidad del epítopo para el reconocimiento efectivo por parte de los anticuerpos específicos del objetivo. Esto concuerda con otros informes que confirman que los antígenos de fusión marcados con His pueden ser inmovilizados directamente en diferentes superficies con orientaciones de la proteína completamente compatibles con el reconocimiento de los anticuerpos37, 38, 39, 40. Para simplificar y reducir el costo y el tiempo del ensayo, llevamos a cabo la inmovilización directa de la proteína S1 para la detección de Ig específica.

Teniendo en cuenta que la vinculación rápida del objetivo es esencial para la aplicación con éxito de nuestra plataforma propuesta como sistema POC, investigamos cómo el tiempo de incubación del objetivo (o de la muestra) afecta a la respuesta de cada uno de los biosensores que componen nuestra plataforma RapidPlex del SARS-CoV-2. La figura 2E resume las señales amperométricas obtenidas para cada una de las cuatro unidades de detección en diferentes tiempos de incubación (1, 5 y 10 min) en ausencia (blanco, B) y presencia (S) de 500 pg mL-1, 250 ng mL-1, y 50 ng mL-1 de NP, isotipos IgG e IgM específicos del SARS-CoV-2, y CRP, respectivamente. Es importante señalar que, si bien en la mayoría de los estudios realizados en este caso se seleccionó un tiempo de incubación de 10 minutos a fin de asegurar la máxima sensibilidad para la determinación de los niveles ultrabajos de cada molécula objetivo, se obtiene una diferencia significativa entre la ausencia y la presencia de cada uno de los objetivos correspondientes con un tiempo de incubación de sólo 1 minuto. Esto proporciona una de las principales ventajas de nuestro sistema RapidPlex del SARS-CoV-2 como dispositivo de POC rápido para la vigilancia de la infección por el SARS-CoV-2 con la sensibilidad necesaria para la determinación tanto de la proteína como de la Ig. Recientemente se ha informado de la existencia de ELISA17 , 41, 42, 43, 44 amplificación del ácido nucleico45, 46, 47, 48, 49 espectrometría de masas50 o incluso combinaciones51 para la determinación de las moléculas diana específicas del SARS-CoV-2 propuestas, entre otras. Sin embargo, la mayoría de estos métodos presentan dificultades cruciales, principalmente en lo que respecta a la preparación de las muestras, la complejidad y los requisitos de equipo costoso y voluminoso, por lo que sigue siendo muy difícil aplicarlos como sistemas de POC. Nuestro dispositivo ofrece una alternativa atractiva a los ensayos estándar para la determinación de proteínas, como ELISA, debido a sus capacidades de multiplexación, su funcionalidad remota y su corto tiempo de muestreo a respuesta.

El rendimiento de cada biosensor contenido en el SARS-CoV-2 RapidPlex se caracterizó en soluciones salinas tamponadas con fosfato (PBS) complementadas con 1,0% de BSA mediante la medición de la lectura amperométrica en presencia de concentraciones aumentadas de NP, S1-IgG, S1-IgM y CRP (Figura 3 ). Las estrategias seleccionadas para el antígeno vírico NP y las proteínas CRP se basan en configuraciones de doble sándwich y sándwich, respectivamente, como se ilustra en la figura 3A. Los inmunoensayos en sándwich para la detección de antígenos son, en general, muy sensibles debido a la participación de dos anticuerpos diferentes como entidades de captura y detección. En función de los bajos niveles que deben alcanzarse para NP y CRP en suero y saliva diluidos (pg mL-1 a ng mL-1), creemos que estas estrategias son las más adecuadas para ser implementadas en nuestra plataforma. La variación de las corrientes catódicas con la concentración para NP y CRP en soluciones tamponadas se presenta en las figuras 3B y 3C, respectivamente. La detección de S1-IgG y S1-IgM se ha basado en inmunoensayos indirectos (figura 3D), que se consideran muy adecuados para la detección de macromoléculas circulantes en antisueros y otros biofluidos. Las figuras 3E y 3F muestran las curvas de calibración para la determinación de Ig específicas de S1 (S1-IgG y S1-IgM, respectivamente) en soluciones tamponadas. La reproducibilidad se demostró mediante los valores de la desviación estándar relativa (RSD) obtenidos con diferentes biosensores preparados de la misma manera en días diferentes. Los valores de RSD de 6,3%, 8,4%, 6,0% y 7,6% para 20 ng mL-1 CRP, 250 ng mL-1 S1-IgG, 250 ng mL-1 S1-IgM y 500 pg mL-1 NP antigen (n = 5) demuestran una buena reproducibilidad tanto en la preparación del dispositivo como en la transducción de la señal. Además, los sensores mostraron respuestas estables durante un período de almacenamiento de 5 días a 4°C (Figura S4). No observamos variaciones significativas de la pendiente entre los datos obtenidos en suero humano debidamente diluido y en soluciones tamponadas para la determinación de cada analito objetivo (por ejemplo, el valor de sensibilidad de la pendiente [16,28 nA mL ng-1] obtenido para la PCR como analito modelo en soluciones tamponadas con PBS es casi el mismo que el de las muestras de suero diluido de un voluntario sano [16.64 nA mL ng-1]); por lo tanto, se puede llevar a cabo una cuantificación precisa de los analitos diana propuestos realizando una simple interpolación de las lecturas catódicas obtenidas para cada muestra analizada en la correspondiente curva de calibración construida en solución amortiguada.

Dado que la sensibilidad diagnóstica y la especificidad de los estudios de seroprevalencia pueden mejorarse utilizando una mezcla de proteínas antigénicas en lugar de una sola proteína52 , 53 modificamos el grafeno con una mezcla de antígenos relacionados con el SARS-CoV-2, NP y S1, para capturar isotipos específicos de inmunoglobulinas contra ambos antígenos en el mismo WE. En la figura S5 se muestra una curva de calibración para la detección de (NP + S1)-IgG. Así pues, esta metodología puede adaptarse para detectar isotipos específicos de IgG (o IgM) o una combinación de ambos isotipos de Ig en la misma superficie de detección para captar mejor la concentración total de Ig y aumentar así la sensibilidad del ensayo en toda la población de pacientes.

Los biofluidos humanos contienen una mezcla compleja y variable de moléculas circulantes que podrían interferir con la detección molecular. Además, la insignificante diafonía entre las diferentes superficies de trabajo es un requisito esencial para realizar lecturas de detección multiplexadas de forma precisa y significativa. Por consiguiente, se evaluaron la selectividad y la diafonía de la plataforma RapidPlex del SARS-CoV-2. Las lecturas amperométricas obtenidas para cada biosensor desarrollado contra moléculas no objetivo se presentan en la figura 4 A. Se evaluó la unión específica de los biomarcadores del SARS-CoV-2 en comparación con los biomarcadores de coronavirus similares, incluidos el SARS-CoV y el MERS-CoV. No observamos ninguna reacción cruzada significativa para los ensayos NP, S1-IgG, S1-IgM y CRP en presencia de cada interferente probado, incluyendo SARS-CoV-2 S1, SARS-CoV S1 y CRP (para el ensayo NP), SARS-CoV-2 NP-IgG, SARS-CoV IgG, MERS-CoV IgG, S1-IgG, y controles negativos que contienen mezclas de IgG e IgM contra MERS-CoV y SARS-CoV (para ensayos de S1-IgG y S1-IgM), y péptido natriurético de tipo B (BNP), NP, SARS-CoV NP, y SARS-CoV S1 (para ensayo CRP), respectivamente. Sin embargo, la interferencia del antígeno viral del SARS-CoV NP proporcionó una corriente catódica correspondiente al5% de la corriente bruta obtenida para la detección del antígeno específico del NP. Las proteínas de la espiga, la envoltura y la membrana del SARS-CoV-2 comparten una identidad de secuencia del 76%-95% con las del SARS-CoV. Este porcentaje de homología se reduce al 30%-40% para el MERS-CoV. De manera similar, dado que el NP del SARS-CoV-2 es 90% idéntico al NP del SARS-CoV17 , 54, 55, 56 se esperaba la interferencia observada del antígeno NP del SARS-CoV. Sin embargo, la falta de selectividad en este caso particular no es una preocupación importante debido a la ausencia de nuevos casos de SARS-CoV detectados recientemente; por lo tanto, se puede inferir que esta interferencia no producirá una barrera para la determinación selectiva del PN del SARS-CoV-2 en muestras reales. Evaluamos además las concentraciones derivadas de la amperometría con las concentraciones derivadas de la absorbancia recogidas mediante ELISA. Como se presenta en la figura 4B, los resultados de nuestro biosensor electroquímico funcionalizado se correlacionaron linealmente (r = 0,955) con los resultados utilizando los mismos reactivos en un protocolo ELISA tradicional.

Una vez que el rendimiento y la selectividad de cada biosensor construido fue evaluado individualmente y exhaustivamente, demostramos las capacidades de multiplexación de nuestro dispositivo de matriz de grafeno de cuatro electrodos de trabajo (4WEs) diseñado con un Ag/AgCl RE y un grafeno CE. El diagrama de bloques que muestra las unidades funcionales que constituyen el sistema electrónico integrado se ilustra en las figuras 4C y 4D. Las lecturas amperométricas de los cuatro canales se toman simultáneamente y los datos se transmiten de forma inalámbrica a un dispositivo de usuario a través de Bluetooth. El sistema electrónico, que incluye la placa de circuito impreso (PCB) y una batería de polímero de iones de litio, tiene unas dimensiones de 20 × 35 × 7,3 mm. El dispositivo compacto puede realizar mediciones amperométricas de forma continua durante más de 5 h con una sola carga.

Con el objetivo de demostrar la utilidad de nuestra matriz SARS-CoV-2 RapidPlex para la cuantificación multiplexada y simultánea de moléculas objetivo seleccionadas, evaluamos la posible reacción cruzada resultante de la difusión de sustancias de señal entre inmunosuperficies adyacentes. Para ello, cada una de las cuatro superficies de trabajo convenientemente funcionalizadas se incubaron con soluciones tamponadas que contenían una concentración significativamente alta de cada uno de los blancos seleccionados, seguidas de los correspondientes receptores detectores en cada caso. La ausencia de diafonía entre los WEs adyacentes se verifica a partir de las lecturas experimentales en soluciones tamponadas que contienen 1,0 ng mL-1 antígeno NP (I), 250 ng mL-1 IgG (II) e IgM (III) específicos de S1, y 50 ng mL-1 CRP (IV) (Figura 4E). Como se había previsto, se obtuvo una señal significativamente más alta cuando cada objetivo fue capturado específicamente y posteriormente etiquetado por su anticuerpo trazador en la correspondiente inmunosuperficie funcionalizada. Estos resultados, junto con los de la figura 4A, demuestran la viabilidad de la plataforma RapidPlex del SARS-CoV-2 desarrollada para la determinación rápida, selectiva y fiable de los isotipos NP, S1-IgG y S1-IgM, y de la PCR en un solo experimento. Cabe señalar que, dado que la IgG y la IgM tienen mecanismos de unión similares a los de los antígenos virales y la cuantificación individual de las inmunoglobulinas no requiere la mezcla de las etiquetas de los detectores específicos, se utilizaron gotas individuales en los electrodos sensores de IgG e IgM durante la modificación y el etiquetado.

Para probar la utilidad de nuestro dispositivo en un escenario más complejo y real, evaluamos las capacidades multiplexadas del SARS-CoV-2 RapidPlex en muestras de suero representativas de COVID-19 RT-PCR-negativo y -positivo. Los datos de los sensores de las muestras de suero de un sujeto RT-PCR-negativo (Figura 5 A) y de un paciente RT-PCR-positivo (Figura 5B) muestran una mínima diafonía en una matriz de muestras real y compleja, lo que indica la eficiente funcionalidad del SARS-CoV-2 RapidPlex para diferenciar simultáneamente la presencia sobreexpresada de reporteros de objetivos relacionados con el SARS-CoV-2 en muestras COVID-19-positivas. Además, el dispositivo SARS-CoV-2 RapidPlex es capaz de proporcionar lecturas positivas significativas para todos los objetivos después de incubar la muestra de suero de COVID-19-positivo durante sólo 1 min (Figuras 5C y S6): El mantenimiento de una señal alta en las muestras de pacientes positivos demuestra el gran potencial en la traducción futura del dispositivo SARS-CoV-2 RapidPlex como una herramienta de diagnóstico remoto de POC ultrarrápido.

Para investigar más a fondo la respuesta de NP, S1-IgG, S1-IgM y CRP a la infección por SARS-CoV-2 utilizando nuestros biosensores basados en LEG, medimos cada molécula objetivo en muestras de suero y saliva de sujetos positivos y negativos de COVID-19 confirmados por RT-PCR. Los resultados obtenidos se trazaron como la relación entre las lecturas amperométricas de cada muestra analizada (S) y el respectivo blanco (B) en cada caso para comparar la detección del objetivo en diferentes rangos de concentración. Utilizando los sensores de grafeno, se analizaron un total de 17 muestras de suero probadas por RT-PCR de COVID-19 (10 positivas, 7 negativas) y un total de 8 muestras de saliva probadas por RT-PCR de COVID-19 (5 positivas, 3 negativas) (Tabla S1).

Los resultados de las figuras 5D y 5E corroboran que, como era de esperar, en comparación con los sujetos RT-PCR-negativos, los pacientes RT-PCR-positivos para COVID-19 muestran niveles significativamente elevados de los objetivos seleccionados tanto en las muestras de suero como de saliva, con ratios S/B medianos de 10,53, 11,62, 10,67 y 12,39 en el suero y 2,81, 3,24, 1,62 y 1,76 en la saliva, para NP, S1-IgG, S1-IgM y CRP, respectivamente. Observamos una concentración de NP en el rango de 0,1-0,8 μg mL-1 y 0,5-2,0 ng mL-1 en el suero y la saliva de los pacientes de COVID-19, respectivamente; S1-IgG en el rango de 20-40 μg mL-1 y 0,2-0.5 μg mL-1 en el suero y la saliva del paciente COVID-19, respectivamente; S1-IgM en el rango de 20-50 μg mL-1 y 0,6-5,0 μg mL-1 en el suero y la saliva del paciente COVID-19, respectivamente; y CRP en el rango de 10-20 μg mL-1 y 0,1-0,5 μg mL-1 en el suero y la saliva del paciente COVID-19, respectivamente. El hecho de que todas las muestras positivas muestren señales mucho más altas en comparación con las muestras negativas demuestra la verdadera utilidad para la evaluación precisa de los biomarcadores de COVID-19 en los biofluidos utilizando nuestros biosensores basados en LEG. En particular, la importante presencia observada de biomarcadores de COVID-19 en la saliva demuestra la excepcional utilidad de este biofluido como una valiosa fuente para el diagnóstico y la vigilancia no invasiva de la infección por SARS-CoV-2.

Con el fin de confirmar la relación entre los niveles de los biomarcadores inflamatorios implicados en la tormenta de citoquinas directamente asociados con la progresión, la gravedad y el resultado de la enfermedad en COVID-19,57, 58, 59, 60, 61, 62 evaluamos la variación de los niveles séricos de CRP en sujetos RT-PCR-negativos (n = 7) y en pacientes COVID-19 RT-PCR-positivos que se clasificaron clínicamente según la gravedad de la enfermedad como asintomáticos (n = 2), leves (n = 5) y moderados (n = 2). Como se muestra en la figura 5F, observamos una asociación positiva entre la concentración de PCR y el grado de gravedad de los síntomas de COVID-19, lo que concuerda con los recientes informes de la literatura20 , 61 . Se requieren pruebas clínicas futuras que utilicen muestras de saliva y suero emparejadas durante el curso de la infección para determinar la relación entre las concentraciones de saliva y suero y validar la utilidad de nuestra plataforma para identificar COVID-19 específicos de la gravedad (Tabla 1).

Para hacer frente a la creciente demanda de herramientas de diagnóstico eficaces para la detección sencilla de COVID-19 con una respuesta inmediata de muestra a muestra, hemos desarrollado e implementado la primera plataforma electroquímica multiplexada basada en gráficos, SARS-CoV-2 RapidPlex, para el interrogatorio simultáneo sensible, rápido y selectivo del antígeno viral NP, los isotipos S1-IgG y S1-IgM, y la PCR en suero y biofluidos salivares de pacientes sanos y con infección por COVID-19 confirmada por RT-PCR. La combinación de las ventajosas propiedades del material de grafeno con la alta sensibilidad y especificidad de las estrategias de inmunosensibilización hace que nuestra plataforma RapidPlex del SARS-CoV-2 sea un dispositivo de diagnóstico prometedor para la vigilancia precisa de la infección por COVID-19 en suero y fluidos corporales de acceso no invasivo, libre de los complejos requisitos de pretratamiento de muestras. Debido a la facilidad de uso, la compatibilidad de las muestras de saliva y la rapidez de los resultados, la plataforma RapidPlex del SARS-CoV-2 tiene un gran potencial para su aplicación en el POC para el triaje de pacientes, así como para su uso en el hogar para la atención de telemedicina y la vigilancia a distancia.

La vigilancia de los objetivos seleccionados en un experimento único y rápido (la captura de los objetivos puede ser de tan sólo 1 minuto) proporciona información sustancial, no sólo sobre la infección temprana por COVID-19 mediante la detección del antígeno vírico y el isotipo IgM, sino también sobre la gravedad de la enfermedad mediante la evaluación de la PCR y la posible inmunidad adquirida mediante la cuantificación del isotipo IgG. La rápida evaluación in situ de la gravedad de la enfermedad que permite nuestro SARS-CoV-2 RapidPlex introduce la ventaja sin precedentes del triaje inmediato de COVID-19. En futuras aplicaciones clínicas, esto podría no sólo alertar a los médicos de los casos que requieren una atención médica importante y cuidadosa, sino también facilitar la asignación eficiente de valiosos recursos médicos, como ventiladores y camas de la UCI, en caso de que resurjan brotes para optimizar los resultados de los pacientes bajo una sobrecarga de los sistemas de atención sanitaria locales.

Las metodologías que proponemos, basadas en técnicas de funcionalización de superficies y principios de detección simples pero bien establecidos, permiten traducir fácilmente la detección de otros reporteros altamente informativos relacionados con el SARS-CoV-2 con sólo cambiar el receptor de captura del revestimiento. Se podría lograr una mayor mejora tecnológica introduciendo un proceso de manipulación de muestras totalmente automatizado mediante un módulo de microfluidos para el despliegue de la telemedicina. La modificación del diseño de nuestra plataforma podría permitir la realización de pruebas rápidas de panel de antígenos y anticuerpos virales, de manera que la infección por COVID-19 pudiera distinguirse claramente de los síntomas inespecíficos de las infecciones respiratorias estacionales, como la gripe. Además, la plataforma de diagnóstico de telemedicina inalámbrica, cuando se combina con los nuevos biosensores portátiles para supervisar continuamente los signos vitales y otros biomarcadores químicos, podría proporcionar información completa sobre el estado de salud de un individuo durante la pandemia de COVID-19.63, 64, 65, 66, 67

Nuestra plataforma es pionera en la detección multiplexada de biomarcadores específicos de la etapa del SARS-CoV-2 para proporcionar una instantánea detallada y personalizada de la infección por COVID-19. Creemos firmemente que nuestra plataforma desarrollada será un método de prueba de gran utilidad para luchar contra esta y futuras pandemias, ayudando a poner fin a una de las crisis sanitarias, económicas y humanitarias más profundas de la historia moderna.