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Imágenes cerebrales de superresolución
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La luz -y todas las ondas- puede doblarse alrededor de las esquinas de los obstáculos que se encuentran en su camino. Debido a este fenómeno, llamado difracción, es imposible enfocar la luz en un punto que sea más pequeño que la mitad de su longitud de onda. En otras palabras, la máxima resolución que se puede alcanzar teóricamente con un microscopio óptico es de aproximadamente 250 nm, una barrera denominada límite de difracción. Por desgracia, esta resolución no es suficiente para observar estructuras celulares finas, como las que se encuentran en las neuronas.
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Durante más de un siglo, los microscopistas se vieron limitados por esta barrera clásica hasta la invención de la microscopía de fluorescencia de superresolución. A finales de la década de 1990 se desarrolló un método especialmente potente, denominado microscopía de emisión estimulada (STED). Esta técnica requiere que la muestra objetivo contenga fluoróforos, que son compuestos que absorben la luz a una longitud de onda y luego la reemiten a una más larga. En la versión más sencilla de la microscopía STED, los fluoróforos se excitan en un punto circular mediante la irradiación con un láser enfocado de difracción limitada. A continuación, se irradia una porción en forma de donut alrededor del punto con luz menos energética -el haz de agotamiento- que apaga la fluorescencia mediante el proceso de emisión estimulada. Así, el efecto neto es que sólo los fluoróforos en el centro del donut vuelven a emitir fotones, y como esa zona puede hacerse arbitrariamente pequeña, esto permite la microscopía de superresolución.
Aunque la microscopía STED supuso un verdadero avance para observar la morfología de las neuronas vivas con mayor resolución, todavía hay margen de mejora. En un estudio reciente publicado en Neurophotonics, un equipo de científicos dirigido por el Dr. U. Valentin Nägerl, de la Universidad de Burdeos, ha desarrollado un método de calibración sencillo pero eficaz que permite obtener imágenes STED más precisas a mayor profundidad del tejido. Su enfoque se basa en el análisis y la corrección de una de las principales fuentes de error sistemático en la microscopía STED para muestras biológicas: la aberración esférica del haz de depleción.
Al obtener imágenes de una muestra de tejido a profundidades superiores a 40 μm, el haz depletivo sufre varios tipos de desenfoque y degradación (aberración) y pierde su forma cuidadosamente elaborada, que es esencial para el método STED. La aberración esférica es la más perjudicial y fue el objetivo de los investigadores. Su estrategia consistió en preparar primero una muestra fantasma de tejido cerebral, un sustituto a base de gel con un índice de refracción similar al del cerebro real. Esta muestra fantasma contenía fluoróforos y nanopartículas de oro dispersos de forma homogénea, lo que permitió al equipo visualizar y cuantificar claramente cómo se distorsionaba la forma del haz de agotamiento a medida que penetraba más profundamente. A continuación, calcularon los preajustes necesarios que debían hacerse al haz de agotamiento en función de la profundidad del tejido para que su forma final se acercara más a la ideal. Los ajustes se realizaron mediante óptica adaptativa, que es una tecnología desarrollada originalmente por los astrónomos para mejorar las imágenes telescópicas que sufren aberraciones causadas por la atmósfera terrestre.
Una vez calibrada la forma del haz de depleción según las pruebas con fantasmas, los científicos procedieron a obtener imágenes de tejido neural vivo. Compararon los resultados de la microscopía STED normal, la microscopía STED corregida y la microscopía de dos fotones, una técnica ajustada específicamente para la obtención de imágenes de tejidos profundos. Los resultados fueron bastante convincentes: las imágenes STED corregidas captaron los detalles finos de las dendritas neuronales más profundas mucho mejor que las imágenes STED estándar. "Utilizando nuestra estrategia de calibración, pudimos medir estructuras neuronales tan pequeñas como 80 nm a una profundidad de 90 μm dentro del tejido biológico y obtener un aumento de la señal del 60 por ciento tras la corrección de la aberración esférica", afirma Nägerl.
Ji Yi, catedrático de ingeniería biomédica de la Universidad Johns Hopkins, comenta: "La microscopía de superresolución se ha aplicado principalmente a muestras finas, como las células de una sola capa, donde la dispersión de la luz es insignificante. El equipo dirigido por Valentin Nägerl implementó la óptica adaptativa en una microscopía de agotamiento de emisión estimulada por dos fotones (2P-STED), y logró una resolución de 80 nm para obtener imágenes de las espinas dendríticas de las neuronas a través de un tejido cerebral de 90 micras. Esto es digno de mención porque la superresolución es difícil de mantener en un tejido más grueso, sobre todo teniendo en cuenta la gran dispersión del tejido cerebral" Yi explica que el avance facilitará el estudio de las actividades e interacciones neuronales.
Teniendo en cuenta que este novedoso proceso de calibración es robusto, sencillo de aplicar y relativamente barato, podría incorporarse fácilmente a las prácticas habituales de laboratorio para obtener mejores resultados con los microscopios STED, siempre y cuando la muestra fantasma preparada coincida con las propiedades ópticas de la muestra biológica. A este respecto, Nägerl afirma: "Nuestro enfoque no se limita a las muestras de cerebro; podría adaptarse a otros tejidos con índices de refracción conocidos y relativamente homogéneos, así como a otros tipos de preparaciones, incluso potencialmente en el cerebro de ratón intacto y vivo."