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Los avances en la detección de patógenos basada en ácidos nucleicos favorecen el diagnóstico rápido de las enfermedades infecciosas a partir de las muestras
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Las pruebas de diagnóstico sensibles, específicas y rápidas son fundamentales para reducir la morbilidad y la mortalidad de los pacientes con enfermedades infecciosas. Las infecciones virales, bacterianas y de otro tipo pueden desarrollarse a partir de un gran número de organismos patógenos y oportunistas, lo que indica la necesidad de contar con diagnósticos versátiles que puedan adaptarse a una amplia variedad de etiologías infecciosas
"Los diagnósticos POC sensibles y específicos para las enfermedades infecciosas no sólo facilitan un tratamiento eficaz, sino que también minimizan el desarrollo de patógenos resistentes a los antibióticos"
Las pruebas de amplificación de ácidos nucleicos (NAAT) se han convertido en un pilar del diagnóstico de las enfermedades infecciosas. Mediante la amplificación y detección de los ácidos nucleicos del organismo objetivo (NAs), las NAATs proporcionan una detección altamente sensible de patógenos en muchas muestras diferentes de pacientes. Las generaciones anteriores de NAAT dependen de protocolos intensivos en mano de obra y de equipos voluminosos que requieren laboratorios centralizados, lo que dificulta la obtención de resultados rápidos y a menudo impide las respuestas clínicas inmediatas
Sin embargo, la tecnología NAAT emergente utiliza protocolos novedosos con preparación de muestras integrada, métodos de amplificación y detección más rápidos, y diseños microfluídicos innovadores para apoyar las pruebas en el punto de atención (POCT) para una serie de enfermedades infecciosas, incluyendo el SARS-CoV-2 y las infecciones de transmisión sexual (ITS) prevalentes en todo el mundo
Estos avances permiten un diagnóstico rápido de la muestra a la respuesta y respuestas clínicas personalizadas, por lo que pueden mejorar significativamente los resultados de los pacientes.
Adaptación de las NAAT a los retos actuales
Las NAAT suelen clasificarse en dos tipos principales de amplificación de NA: PCR y amplificación isotérmica (iNAATs). Tradicionalmente, la PCR requiere un engorroso equipo de laboratorio para hacer pasar las muestras por diferentes temperaturas para su desnaturalización y amplificación, lo que limita intrínsecamente su uso en entornos de POC
Para eludir estas limitaciones, se desarrollaron las iNAAT utilizando la desnaturalización mediada por enzimas, lo que evita la necesidad de repetidos termociclos.1 Desde la aparición de las iNAAT, han surgido varias plataformas que son potencialmente adaptables para el POCT. La amplificación mediada por bucle (LAMP), por ejemplo, utiliza una serie de cebadores internos y externos en combinación con la ADN polimerasa para amplificar el ADN objetivo.2 Aunque la LAMP no es una tecnología nueva, ha demostrado ser una plataforma valiosa para el desarrollo de nuevas NAAT
De relevancia actual para la actual pandemia de COVID-19, la LAMP se utilizó para desarrollar un ensayo altamente sensible y específico para el SARS-CoV-2, que permite obtener resultados fáciles de leer en menos de una hora.3 Mammoth Biosciences combinó la revolucionaria tecnología CRISPR con un ensayo de SARS-CoV-2 basado en la LAMP para mejorar la detección tras la amplificación de la NA del nuevo coronavirus
El ensayo DETECTRTM basado en CRISPR-Cas12 proporciona un tiempo entre la muestra y el resultado de aproximadamente 45 minutos, en comparación con las cuatro horas de los métodos qRT-PCR establecidos, y actualmente se está revisando para la aprobación de la FDA, a la espera de la validación clínica.4 Es fundamental que los diagnósticos POC basados en NAAT faciliten el inicio inmediato de los protocolos de tratamiento de COVID-19 para prevenir la enfermedad grave y la mortalidad
Evolución del panorama del diagnóstico de las ITS
Los diagnósticos POC sensibles y específicos para las enfermedades infecciosas no sólo facilitan un tratamiento eficaz, sino que también minimizan el desarrollo de patógenos resistentes a los antibióticos. Los casos notificados de ITS prevalentes en todo el mundo, como la clamidia y la gonorrea, han mostrado un aumento anual significativo en los últimos años, lo que indica la necesidad de mejorar los métodos de detección y los protocolos de tratamiento más personalizados.5 Como resultado, el diagnóstico de las ITS se ha convertido en una fuente sustancial de innovación para la tecnología POCT
La aplicación de la microfluídica, que permite la regulación de fluidos sensibles dentro de un único componente portátil, a la tecnología existente, como la amplificación de la PCR, ha ampliado de forma espectacular las pruebas POC para las ITS y otras enfermedades infecciosas
"A través de la amplificación y detección de los ácidos nucleicos del organismo objetivo (NAs), las NAATs proporcionan una detección altamente sensible de patógenos en muchas muestras diferentes de pacientes"
Estas plataformas no sólo alivian la necesidad de equipos de laboratorio, sino que también pueden integrar la extracción de NA, minimizando los protocolos de preparación de muestras.6 Por ejemplo, la plataforma binx health io, aprobada por la FDA, utiliza un chip de microfluidos para una PCR ultrarrápida combinada con una tecnología de detección electroquímica propia, lo que permite un cribado POC altamente sensible y específico para gonorrea y clamidia en aproximadamente 30 minutos.5
Varias nuevas y prometedoras pruebas NAAT POC que utilizan plataformas microfluídicas ultrarrápidas similares siguen en desarrollo o en ensayos clínicos, lo que demuestra la gran demanda de diagnósticos rápidos de muestra a respuesta. La prueba de salud sexual de Visby Medical utiliza la PCR para la detección de clamidia, gonorrea y tricomonas en menos de 30 minutos, y la MobiNAAT realiza la PCR utilizando microfluidos de gota en un cartucho independiente que incluye todos los reactivos necesarios para la extracción y amplificación de NA.5 Sorprendentemente, la MobiNAAT puede detectar la gonorrea y determinar la susceptibilidad a los antibióticos en 15 minutos, facilitando protocolos de tratamiento personalizados que pueden reducir la prevalencia de las infecciones resistentes a los antibióticos.5
Las Directrices de Tratamiento de ITS 2021 de los CDC, recientemente publicadas, sugieren el uso de POC NAATS para la detección de clamidia y gonorrea,7 y es probable que las directrices futuras incluyan más pruebas rápidas de muestra a respuesta que detecten una variedad de ITS a medida que obtengan la aprobación de la FDA.
Llevar las pruebas ultrarrápidas de muestra-respuesta a la clínica
A pesar de la promesa de nuevas pruebas NAAT POC en el horizonte, la descentralización de los diagnósticos de los laboratorios a las clínicas viene con desafíos. Las pruebas POC necesitan conseguir el estatus de exención de las Enmiendas para la Mejora de los Laboratorios Clínicos (CLIA) de la FDA para poder ser realizadas por personal ajeno a los laboratorios. Por ello, el acceso a los laboratorios certificados por la CLIA para la validación clínica puede ser un impedimento importante para la aprobación de algunas pruebas NAAT POC
No obstante, el avance de la tecnología portátil y los enfoques innovadores para la amplificación y detección de NA apuntan a una nueva y emocionante generación de diagnósticos POC. Estas pruebas tienen el potencial de llevar las pruebas ultrarrápidas de muestra a respuesta directamente a la clínica, apoyar diagnósticos y tratamientos más personalizados y mejorar los resultados de los pacientes con enfermedades infecciosas.
Referencias:
1. Lee SH, Park SM, Kim BN, Kwon OS, Rho WY, Jun BH. Emerging ultrafast nucleic acid amplification technologies for next-generation molecular diagnostics. Biosens Bioelectron. 2019;141:111448
2. Notomi T, Okayama H, Masubuchi H, et al. Amplificación isotérmica del ADN mediada por bucle. Nucleic Acids Res. 2000;28(12):E63
3. Yan C, Cui J, Huang L, et al. Rapid and visual detection of 2019 novel coronavirus (SARS-CoV-2) by a reverse transcription loop-mediated isothermal amplification assay. Clin Microbiol Infect. 2020;26(6):773-779.
4. Broughton JP, Deng X, Yu G, et al. CRISPR-Cas12-based detection of SARS-CoV-2. Nat Biotechnol. 2020;38(7):870-874
5. Gaydos CA, Manabe YC, Melendez JH. Una revisión narrativa de dónde estamos con las pruebas de infecciones de transmisión sexual en los puntos de atención en los Estados Unidos. Sex Transm Dis. i 2021;48(8S):S71-S77
6. Sachdeva S, Davis RW, Saha AK. Microfluidic point-of-care testing: commercial landscape and future directions. Front Bioeng Biotechnol. 2021;8:602659
7. Workowski KA, Bachmann LH, Chan PA, et al. Sexually Transmitted Infections Treatment Guidelines, 2021. MMWR Recomm. 2021;70(4):1-187.
