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Una rápida introducción sobre la tecnología de investigación de la biología molecular: PCR
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Una rápida introducción sobre la tecnología de investigación de la biología molecular: PCR
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La reacción en cadena de la polimerasa (PCR) es un método ampliamente utilizado para hacer rápidamente de millones a miles de millones de copias (completas o parciales) de una muestra específica de ADN, lo que permite a los científicos tomar una muestra muy pequeña de ADN y amplificarla (o una parte de ella) hasta una cantidad lo suficientemente grande como para estudiarla en detalle. La PCR fue inventada en 1983 por el bioquímico estadounidense Kary Mullis en Cetus Corporation; Mullis y el bioquímico Michael Smith, que había desarrollado otras formas esenciales de manipular el ADN, recibieron conjuntamente el Premio Nobel de Química en 1993.
Los pasos individuales comunes a la mayoría de los métodos de PCR son los siguientes
Inicialización: Este paso sólo es necesario para las polimerasas de ADN que requieren la activación por calor mediante la PCR de arranque en caliente. Consiste en calentar la cámara de reacción hasta una temperatura de 94-96 °C (201-205 °F), o 98 °C (208 °F) si se utilizan polimerasas extremadamente termoestables, que se mantiene durante 1-10 minutos.
Desnaturalización: Este paso es el primer evento cíclico regular y consiste en calentar la cámara de reacción a 94-98 °C (201-208 °F) durante 20-30 segundos. Esto provoca la fusión del ADN, o desnaturalización, de la plantilla de ADN de doble cadena al romper los enlaces de hidrógeno entre las bases complementarias, dando lugar a dos moléculas de ADN de cadena simple.
Recocido: En el siguiente paso, la temperatura de la reacción se reduce a 50-65 °C (122-149 °F) durante 20-40 segundos, lo que permite el recocido de los cebadores a cada una de las plantillas de ADN monocatenario. Normalmente se incluyen dos cebadores diferentes en la mezcla de reacción: uno para cada uno de los dos complementos monocatenarios que contienen la región objetivo. Los cebadores son secuencias monocatenarias en sí mismas, pero son mucho más cortos que la longitud de la región diana, complementando sólo secuencias muy cortas en el extremo 3' de cada cadena.
Es fundamental determinar una temperatura adecuada para el paso de recocido, ya que la eficacia y la especificidad se ven muy afectadas por la temperatura de recocido. Esta temperatura debe ser lo suficientemente baja como para permitir la hibridación del cebador con la hebra, pero lo suficientemente alta como para que la hibridación sea específica, es decir, el cebador debe unirse sólo a una parte perfectamente complementaria de la hebra, y a ninguna otra. Si la temperatura es demasiado baja, el cebador puede unirse de forma imperfecta. Si la temperatura es demasiado alta, el cebador puede no unirse en absoluto. Una temperatura de recocido típica es de unos 3-5 °C por debajo de la Tm de los cebadores utilizados. Los enlaces de hidrógeno estables entre las bases complementarias sólo se forman cuando la secuencia del cebador coincide estrechamente con la secuencia del molde. Durante este paso, la polimerasa se une al híbrido cebador-plantilla y comienza la formación de ADN.
Extensión/elongación: La temperatura en este paso depende de la ADN polimerasa utilizada; la temperatura óptima de actividad para la ADN polimerasa termoestable de la Taq polimerasa es de aproximadamente 75-80 °C (167-176 °F),[14][15] aunque comúnmente se utiliza una temperatura de 72 °C (162 °F) con esta enzima. En este paso, la ADN polimerasa sintetiza una nueva cadena de ADN complementaria a la cadena molde de ADN mediante la adición de dNTPs libres de la mezcla de reacción que es complementaria a la plantilla en la dirección 5'-a-3', condensando el grupo 5'-fosfato de los dNTPs con el grupo 3'-hidroxi en el extremo de la cadena de ADN naciente (elongación). El tiempo exacto que se necesita para la elongación depende tanto de la ADN polimerasa utilizada como de la longitud de la región objetivo del ADN a amplificar. Como regla general, a su temperatura óptima, la mayoría de las ADN polimerasas polimerizan mil bases por minuto. En condiciones óptimas (es decir, si no hay limitaciones debidas a sustratos o reactivos limitantes), en cada paso de extensión/elongación, el número de secuencias diana de ADN se duplica. Con cada ciclo sucesivo, las hebras molde originales más todas las nuevas hebras generadas se convierten en hebras molde para la siguiente ronda de elongación, lo que conduce a una amplificación exponencial (geométrica) de la región objetivo de ADN específica.
Los procesos de desnaturalización, recocido y elongación constituyen un único ciclo. Se necesitan múltiples ciclos para amplificar el ADN diana hasta alcanzar millones de copias. La fórmula utilizada para calcular el número de copias de ADN formadas tras un número determinado de ciclos es 2n, donde n es el número de ciclos. Así, una reacción preparada para 30 ciclos da como resultado 230, o 1.073.741.824, copias de la región objetivo original de ADN de doble cadena.
Elongación final: Este único paso es opcional, pero se realiza a una temperatura de 70-74 °C (158-165 °F) (el rango de temperatura requerido para la actividad óptima de la mayoría de las polimerasas utilizadas en la PCR) durante 5-15 minutos después del último ciclo de PCR para asegurar que cualquier ADN monocatenario restante se elongue completamente.
Retención final: El paso final enfría la cámara de reacción a 4-15 °C (39-59 °F) durante un tiempo indefinido, y puede emplearse para el almacenamiento a corto plazo de los productos de la PCR.
Por qué utilizar la PCR de gradiente
La PCR de gradiente se refiere a un instrumento que puede establecer una serie de condiciones diferentes de temperatura de recocido para la amplificación de la PCR en una sola vez. Debido a que los diferentes fragmentos de ADN tienen diferentes temperaturas óptimas de recocido, el instrumento de PCR de gradiente se puede utilizar para establecer una serie de temperaturas de recocido de gradiente para la amplificación, de modo que la amplificación de PCR de una sola vez puede seleccionar las temperaturas óptimas de recocido con alta expresión, optimizar las condiciones de reacción y llevar a cabo una amplificación eficaz.
En el estado ideal, la temperatura de recocido es lo suficientemente baja para asegurar el recocido efectivo de los cebadores con la secuencia objetivo, y lo suficientemente alta para reducir la unión no específica.
Termociclador de gradiente PCR M2-96G
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