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¿Cómo preparar rápidamente muestras de suspensión de células nerviosas de rata o ratón de alta calidad?
Las neuronas (también llamadas neuronas o células nerviosas) son las unidades fundamentales del cerebro y del sistema nervioso, el aislamiento y cultivo de nervios in vitro ha demostrado ser un enfoque muy poderoso para abordar el proceso neurobiológ
Los cultivos de neuronas primarias son poderosos sistemas modelo que se utilizan para estudiar la morfología y la diferenciación de las neuronas, la función sináptica y la liberación de neurotransmisores, la neurotoxicidad durante el desarrollo preclínico de fármacos y el modelado de enfermedades. Dado que las neuronas no se dividen y proliferan nuevamente después de la separación, establecer un método fácil, reproducible y rentable para aislar y cultivar las células nerviosas primarias haría avanzar enormemente la investigación en neurociencia.
Sin embargo, las neuronas primarias son muy sensibles a las condiciones de aislamiento y su entorno de cultivo o crecimiento. Debido a que los métodos difieren de un laboratorio a otro, los rendimientos celulares, la viabilidad y las tasas de maduración son muy variables y dificultan la comparación de resultados y la repetición de experimentos entre laboratorios.
Entonces, ¿cómo preparar rápidamente muestras de suspensión de células nerviosas de rata/ratón de alta calidad?
En comparación con los ratones recién nacidos, la disociación del cerebro de rata adulta es más compleja y requiere una combinación de hidrólisis mecánica y enzimática para degradar la matriz extracelular. Por lo general, la eliminación de la mielina requiere un período de incubación prolongado con enzimas de digestión, desintegración mecánica severa y/o pasos adicionales para la purificación de la mielina, lo que en conjunto compromete la recuperación y viabilidad de las suspensiones de células primarias.
En este protocolo, describimos un método para aislar células neurales de ratón utilizando una formulación de enzimas de digestión de tejido suave. Los instrumentos experimentales detallados, los materiales y el procedimiento experimental se enumeran a continuación.
Instrumentos y materiales experimentales.
Disociador de suspensión de una sola célula RWD DSC-400;
RWD HJ-400 Camisa calefactora;
RWD DHABE-5003 Kit de digestión enzimática de cerebro adulto de alta actividad (ratón y rata);
Tubo de procesamiento de tejidos RWD SCT-100;
Filtro de celda de 70 μm;
RWD Animal instrumento quirúrgico;
suministros de cultivo celular; Pipeta.
Procedimiento experimental
De acuerdo a las instrucciones, mezcle la enzima MIX y actívela al baño maría a 37℃.
Los tejidos cerebrales de ratas adultas (P>7) se diseccionaron y almacenaron temporalmente en placas de Petri que contenían HBSS (Ca2+ y Mg2+). Los vasos sanguíneos de los tejidos cerebrales se extirparon suavemente tanto como fue posible con pinzas
Coloque el tejido cerebral y la enzima MIX en el tubo de procesamiento de tejido y corte todo el cerebro en 4 piezas con unas tijeras.
Invierta el tubo de tratamiento de tejido al disociador de suspensión de una sola célula, instale la camisa de calefacción y ejecute el programa M_ABrain_Heater_2.
Las muestras de suspensión celular se filtraron con un filtro celular y se centrifugaron durante 10 min a 300 xga temperatura ambiente.
6. Transfiera la suspensión celular a un tubo de centrífuga de 15 ml, agregue el reactivo de desfragmentación, mezcle bien, extienda la capa superior con PBS preenfriado y centrifugue a 3000 × g durante 10 min a 4 ℃ con velocidad de aumento 5 y velocidad de disminución 3. El mantener la capa inferior de gránulos celulares, lavar y recoger.
7. Operación de grietas rojas (opcional).
8. Recuento celular y citometría de flujo
Las células de tejido cerebral de ratón adulto procesadas por el aparato disociador de suspensión de células individuales RWD pueden alcanzar el 90 % de viabilidad celular, que es el porcentaje ideal para el experimento posterior. El kit de enzimólisis suave de tejido cerebral adulto de ratón DHABE-5003 de RWD se puede utilizar para disociar la suspensión de una sola célula de tejido cerebral completo de rata o ratón adulto (P>7). También puede apoyar el aislamiento de todas las células neurales y no neurales en el cerebro.
