Más información sobre la fotometría de fibra: principio de funcionamiento y proceso

Este artículo contiene más de 3000 palabras para explicar el principio de funcionamiento y las ventajas, y muestra los pasos para configurar el experimento correspondiente.

A. Principio de funcionamiento de la fotometría de fibra.

B. Ventajas de la fotometría de fibra.

C. ¿Cómo utilizar la tecnología de fotometría de fibra?

D. Configuración del sistema de fotometría de fibra y registro de una buena señal.

F. Análisis de datos de fotometría de fibra.

A. Fotometría de fibra Principio de funcionamiento

El cerebro humano tiene alrededor de 90 mil millones de neuronas, que están interconectadas por sinapsis para formar una red neuronal compleja y, por lo tanto, producen varias funciones complejas. El cerebro puede sintetizar y liberar cientos de neurotransmisores, y las señales nerviosas se transmiten entre las neuronas a través de los neurotransmisores liberados por las sinapsis. Cuando la excitación nerviosa se transmite al final de la sinapsis, estimulará el canal de calcio en la sinapsis para que se abra y promueva la entrada de iones de calcio, y la concentración de iones de calcio intracelulares aumentará instantáneamente, impulsando a las vesículas sinápticas a liberar neurotransmisores. en el espacio sináptico, y que se unirá a los receptores en la membrana postsináptica y transmitirá las señales del neurotransmisor a la siguiente neurona, transmitiendo así la información paso a paso

Tomando como ejemplo la detección de la señal de fluorescencia de calcio, el principio técnico del sistema de fotometría de fibra es utilizar un indicador fluorescente especial o una sonda de fluorescencia con la ayuda de la estricta correspondencia entre el cambio de concentración de calcio y la actividad neuronal. La concentración de calcio en la neurona se expresa a través de la intensidad de la fluorescencia y es captada por el sistema de fotometría de fibra, para lograr el propósito de detectar la actividad neuronal.

En el sistema nervioso, la concentración de calcio intracelular de las neuronas en estado de reposo es de 50 a 100 nM, pero cuando las neuronas están excitadas, la concentración de calcio intracelular puede aumentar de 10 a 100 veces, por lo que podemos etiquetar los iones de calcio inyectando indicadores de codificación de genes de calcio ( Indicador de calcio, como GCaMP, RCaMP, etc.). Cuando se mejora la actividad neuronal, se abre el canal de calcio, una gran cantidad de calcio ingresa y se une con CaM, lo que resulta en la interacción entre los dominios M13 y CaM, lo que lleva a cpEGFP estructural reordenamiento, mejorando así la señal de fluorescencia verde. (Figura 1) Por lo tanto, podemos caracterizar la actividad de las neuronas detectando los cambios en las señales de calcio, y luego estudiar la correlación entre la actividad neuronal y el comportamiento animal, y explorar el mecanismo regulador detrás del comportamiento complejo .

El principio de la fotometría de fibra para la detección de señales de neurotransmisores es el mismo que el anterior. Se ha desarrollado una nueva serie de sondas fluorescentes codificables genéticamente, denominadas GRAB (basadas en activación de GPCR). Al incorporar una proteína fluorescente (cpEGFP) sensible a los cambios estructurales en el receptor del neurotransmisor, el grupo de investigación pudo convertir la señal química del neurotransmisor en una señal fluorescente y, en combinación con las técnicas de imagen existentes, monitorear los cambios dinámicos de la concentración del neurotransmisor. en tiempo real

B. Ventajas de la fotometría de fibra

El estudio del sistema nervioso de animales despiertos y que se mueven libremente es un tema crucial en la investigación neurocientífica contemporánea. Al detectar señales de calcio asociadas con la actividad neuronal, podemos comprender mejor los circuitos neuronales complejos. En los últimos años, los desarrollos tecnológicos que incluyen la microscopía de dos fotones, la microscopía de un solo fotón y la fotometría de fibra nos han permitido realizar la detección en tiempo real de cambios en las señales de calcio en animales. La aplicación de estas técnicas requiere proteínas fluorescentes diseñadas.

En el pasado, la mayoría de las imágenes de calcio in vivo se realizaban bajo microscopía de dos fotones. La microscopía de dos fotones es una técnica de imagen de fluorescencia en la que dos haces de luz láser coherente se enfocan a través del ocular de un microscopio en un punto definido por una función de dispersión de puntos, similar a la microscopía confocal que excita selectivamente moléculas similares a las fluorescentes. En la microscopía de dos fotones, la longitud de onda de la luz de excitación está cerca de 700-1000 nm, cerca del espectro infrarrojo. Esta es la primera ventaja de las imágenes de dos fotones in vivo: las longitudes de onda de luz más largas se dispersan menos en el tejido y penetran a mayor profundidad. El segundo es la buena resolución que permite la visualización no solo de las neuronas individuales sino también de la actividad del calcio en los extremos de los axones de las estructuras subcelulares.

Las técnicas de escaneo láser en la microscopía de dos fotones también se utilizan para detectar dinámicas rápidas de calcio en las neuronas durante la formación de imágenes in vivo, pero el poder de excitación para distinguir la señal del ruido generalmente debe ser lo suficientemente alto como para causar algún grado de blanqueo, y los tiempos de espera del fotoblanqueo pueden afectar negativamente la calidad de la imagen.