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¿Cómo manejar la microinyección en Caenorhabditis Elegans? ¡No se pierda los detalles paso a paso!

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La microinyección en C Elegans es la técnica central en el paradigma de investigación de C Elegans. Consulte los detalles del procedimiento experimental paso a paso

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Antecedentes de la microinyección en C elegans

Caenorhabditis elegans (c elegans) es un importante organismo modelo utilizado para el estudio de la genética animal, la ontogenia y la etología. Puede ayudarnos a estudiar el mecanismo de acción desde el nivel molecular y celular hasta el nivel biológico del sistema en lo que respecta al ciclo vital correspondiente. La tecnología de microinyección proporciona un tubo capilar de vidrio con un diámetro de punta de milímetros para la inyección de ácidos nucleicos en la gónada del gusano que posteriormente son absorbidos por los óvulos y generados en forma de conjuntos extracromosómicos. La microinyección es la técnica central en el paradigma de investigación de C elegans. Se utiliza ampliamente en el estudio de la expresión génica, la función génica y las interacciones genéticas dentro del cuerpo de C elegans.

Protocolo de microinyección en C elegans

Paso 1: Preparación de las placas de agar

Deje caer 50ul de solución de agarosa caliente al 2% sobre un cubreobjetos de vidrio de 24 × 60 mm y coloque suavemente otro cubreobjetos encima (tenga cuidado con las burbujas de aire). Después de que la agarosa aplanada se solidifique (~5 min), puede retirar el cubreobjetos de la parte superior deslizándolo suavemente. Deje secar la placa de agar toda la noche a temperatura ambiente o cuézala al horno a 80℃ durante 1 hora. Apile las placas para su uso posterior

Paso 2: Preparación de las agujas

La aguja es la clave del éxito de la microinyección en C elegans. RWD micropipette puller ayuda con la generación de 2 agujas con un rendimiento estable y consistente. Se recomienda utilizar el tubo de vidrio capilar RWD para tirar de la pipeta para llenar la punta de las agujas rápidamente con solución madre. De este modo, las burbujas de aire pueden ser descargadas. En general, los diámetros de la punta son de hasta 1μm y la longitud del cono es de alrededor de 5~7mm.

Paso 3: Preparación del ADN y llenado de una pipeta de carga con aguja

De acuerdo con los requisitos experimentales, elija las sustancias para la solución madre. Por ejemplo, ADN, ARN, proteínas y otras sustancias. La pureza de la solución madre es uno de los factores importantes que afectan a la eficacia de la inyección. Utilice un gotero químico pequeño y fino para introducir la solución madre en la pipeta a través de la punta de las agujas. Después de varios minutos, observe la punta para ver si hay burbujas de aire

Paso 4: Rotura

Coloque el cubreobjetos sobre la placa de agar llena de solución madre. Mueva el micromanipulador RWD para aplastar la aguja contra el borde del portaobjetos de vidrio. Cuando se rompa la punta, la vacuola saldrá al exterior. Este método permite una fácil penetración de la aguja en el gusano

Paso 5: Montaje de los gusanos

Los gusanos grávidos jóvenes suelen seleccionarse para la microinyección, ya que sus gónadas están completamente desarrolladas en esta fase en la que los gusanos se someten fácilmente a la transfección de ADN, lo que da lugar a la generación de descendencia transgénica. Utilice un pico para colocar el gusano en la placa de agar. Ajuste la posición de modo que la gónada quede expuesta al exterior. Añada unas gotas de aceite halocarbónico para cubrir completamente el gusano.

Paso 6: Microinyección

Coloque la placa de agar en la platina mecánica. Localice el gusano en el microscopio y enfoque la gónada ajustando el objetivo condensador. Utilice el micromanipulador RWD para insertar la aguja en la gónada. Encienda la bomba de microinyección de nanolitros RWD para iniciar la inyección

Paso 7: Recuperación del gusano

Añada unas gotas de solución tampón al gusano inyectado bajo el estereomicroscopio. Al cabo de 2-5 minutos, el gusano volverá a estar activo. Debería empezar a nadar y a mover la cabeza de un lado a otro. Para entonces, puede transferirlo de nuevo a las placas de cultivo celular para su cultivo regular a 20℃.

Precauciones[2]

Placas de agar: Si el gusano muere rápidamente en la placa de agar, es una indicación de que la placa está demasiado seca. En este caso, puede sustituirse por otra placa con una capa de agar más fina, ya que la agarosa se utiliza principalmente para absorber el agua del gusano; si el gusano no puede adherirse firmemente a la placa, significa que la placa está demasiado húmeda o es demasiado fina. En este caso, se aconseja ponerla en el horno durante un tiempo o pegar el gusano en la placa antes de añadir el aceite halocarbónico

Sustancias para inyección: Mantenga la solución de ADN bien mezclada y centrifugada antes de la inyección para evitar que se obstruya la punta de la aguja. La concentración de ADN debe mantenerse por debajo de 200mg/L ya que una solución de ADN muy concentrada producirá toxinas y dará lugar a una sobreexpresión génica

Orientación de la inyección: La aguja y la gónada deben colocarse en un ángulo agudo. Se recomienda colocar la aguja horizontalmente o en un ángulo de 15° con respecto a la cabeza o la cola.

Muestra utilizada en el experimento: Asegúrese de que los gusanos inyectados estén bien alimentados y sanos.

Alta tasa de mortalidad de los gusanos inyectados: Si el tiempo de recuperación de los gusanos es demasiado largo o demasiado corto, puede deberse a que la aguja es demasiado grande o a que el ADN inyectado está contaminado. Para solucionar este problema, la aguja más fina podría ser el remedio. Además, pruebe a inyectar sólo una gónada cada vez. Si el procedimiento de microinyección se ha realizado correctamente pero no surgen gusanos transgénicos, las posibles razones pueden ser la letalidad inducida por la transformación genética o que los ácidos nucleicos inyectados estén contaminados y sea necesario purificarlos de nuevo

Referencias:

[1] Matthias Rieckher y Nektarios Tavernarakis. Generación de animales transgénicos de Caenorhabditis elegans mediante microinyección de ADN [J].Bio Protocol, 2017, 7(19): e2565.

[2] Krishna S. Ghanta et al., Microinyección para la edición genómica de precisión en Caenorhabditis elegans[J].Star Protocols, 2021, 2(3): 100748.