Manual vs. Automatizado, ¿Cuál elegir para el conteo de células?

conteo celular manual y automatizado

El cultivo celular es un paso crítico en la investigación de biología celular. Para garantizar un crecimiento celular saludable y facilitar los experimentos posteriores, los investigadores deben determinar la curva de crecimiento celular y comprender su estado de crecimiento durante el cultivo celular, por lo que es necesario medir la concentración celular, la viabilidad y la concentración antes de los experimentos posteriores. Normalmente, los métodos de recuento de células incluyen el recuento manual y el recuento automatizado.

Este artículo presenta las ventajas y desventajas del conteo de células manual y el conteo de células automatizado, junto con una introducción detallada de estos dos métodos.

Ventajas y desventajas de la celda manual y automatizada

Contando

Método

Recuento manual de células

Tiempo de conteo: 5 min/muestra

Precisión de conteo individual: baja

Análisis de muestra de conglomerados: Cálculo aproximado

Peligro biológico: Sí

Cálculo secundario: Sí

Área de campo visual: 1 sq. Mm

Gestión de datos:Manual

Costo de consumibles: Bajo

Costo de mano de obra:Alto

Contador de células automatizado

Tiempo de conteo: 9 seg/muestra

Precisión de conteo único: alta

Análisis de muestra de conglomerados: Separación precisa

Peligro biológico: No

Cálculo secundario: No

Área del campo visual: 3,5 mm cuadrados

Gestión de datos: Automatizado

Costo de consumibles: Ligeramente más alto

Costo de mano de obra: bajo

Recuento manual de células

El recuento manual de células, desarrollado por el anatomista e histólogo francés Louis-Charles Malassez en el siglo XVIII, se ha considerado durante mucho tiempo el estándar de oro para la medición de la concentración celular.

Procedimiento para el conteo manual de células por hemocitómetro

1 Recolectar y teñir las células

Recolectar la suspensión celular y teñir con colorantes azul tripán o AO/PI.

2 Limpiar el hemocitómetro

Limpie el hemocitómetro y luego séquelo al aire o use un secador. Y también puedes elegir disolventes orgánicos como etanol al 95%, etanol absoluto o acetona para deshidratarlo. Asegúrese de no frotar el hemocitómetro con algo duro.

3 Coloque el cubreobjetos y cargue la muestra

Coloque el cubreobjetos adecuado sobre el hemocitómetro para formar una cámara de recuento. Pipetee una gota de la suspensión celular en el borde del cubreobjetos y deje que la suspensión celular fluya hacia la cámara de manera suave y uniforme, evitando las burbujas.

4 Observación y posicionamiento del microscopio

Encuentre un campo de visión adecuado bajo el microscopio y observe la muestra de células. Ajuste el enfoque para obtener una vista clara y encuentre el cuadrado objetivo. Cuando utilice colorante AO/PI, utilice un microscopio de fluorescencia para la observación.

5 Conteo manual bajo el microscopio

Mire la muestra bajo el microscopio y cuente el número de células manualmente. Este conteo se repite tres veces, teniendo en cuenta celdas de diferentes tamaños, y se toma el valor medio.

6 Calcular la concentración

Calcule la concentración de células en la muestra utilizando la fórmula de conversión y los datos registrados. Si se utiliza la tinción con azul de tripano, separe las células vivas de las células totales.

7 Limpiar el hemocitómetro

Limpie el hemocitómetro como se describe arriba y guárdelo para uso futuro.

Escenario de aplicación de conteo manual de células

Recuento de células de bajo rendimiento

notas

● La limpieza ocasional del hemocitómetro puede causar riesgos biológicos.

● Debido al material del hemocitómetro, los rayones en la superficie pueden afectar seriamente los resultados experimentales.

● Las impurezas que quedan pueden causar una distribución desigual de las células.

● Los residuos de los agentes de limpieza pueden afectar la viabilidad celular.

● Pocas células agrupadas deben contarse como una sola célula, mientras que las muestras con más agrupaciones deben resuspenderse y medirse.

● El principio de conteo para las celdas presionadas en las líneas de cuadrícula debe determinarse de antemano.

Recuento de células automatizado

Aunque la tabla de conteo de células sanguíneas se considera el estándar de oro para el conteo de células, existen problemas inherentes con su diseño y uso. Se han desarrollado contadores de células automatizados para superar estos problemas.

Hay tres tipos comunes de contadores de células automatizados: contadores de células automatizados basados en visión, contadores de células tipo Coulter y citómetros de flujo.

De estos, el contador de células automatizado basado en visión produce resultados similares al conteo manual, que ahora es el estándar de oro, debido a su alta velocidad de conteo y principios similares. El contador automatizado puede detectar células y partículas y luego aplicar algoritmos para medir la concentración celular, el tamaño y otros parámetros. Esto permite la determinación de la concentración y el número de siembra celular, así como la viabilidad y proliferación celular.

Procedimiento para el conteo de células automatizado

(1) Cosechar y teñir las células.

(2) Cargue la muestra en un portaobjetos de recuento desechable.

(3) Inserte el portaobjetos en el instrumento.

(4) El instrumento muestra los resultados del conteo inmediatamente.

Aplicaciones de recuento de células automatizadas

Recuento de células de alto rendimiento.

Los contadores de células automatizados se pueden utilizar con varios tipos de equipos ópticos y, por lo tanto, se pueden actualizar a contadores de células automatizados de fluorescencia para fluorescencia dual AO/PI directa.

notas

(1) Los parámetros de conteo deben establecerse en función de la muestra.

(2) El multiplicador de predilución debe ingresarse por adelantado.

(3) Debe comprobarse la precisión del enfoque automático y corregirse inmediatamente cualquier desviación.

Resumen

El recuento manual de células con un hemocitómetro a menudo es propenso a errores. Además, la limpieza inadecuada del hemocitómetro puede suponer un peligro biológico. En comparación, el conteo de células automatizado es superior al conteo de células manual en términos de precisión de datos y eficiencia de velocidad. Además, el Formulario Nacional de la Farmacopea de los Estados Unidos (USP-NF) recomienda el uso de al menos dos o más métodos para determinar la viabilidad celular después de la recuperación. Además de la tinción con azul tripán de campo claro, el método de tinción AO/PI se usa comúnmente para el recuento de células vivas basado en fluorescencia. Por lo tanto, un contador de células automatizado con capacidades de fluorescencia es más conveniente para el conteo de células basado en fluorescencia y en campo claro, lo que lo hace más adecuado para los escenarios de investigación de biología celular actuales.