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Uso de la pletismografía de cuerpo entero para estudiar y monitorizar los mecanismos de la tos en ratones

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Pletismografía de cuerpo entero para la investigación del comportamiento de la tos en ratones

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Resumen

La tos es un mecanismo esencial de defensa respiratoria que ayuda a eliminar la mucosidad o las sustancias extrañas de las vías respiratorias. En condiciones normales, es una respuesta fisiológica potente y eficaz. Sin embargo, en estados patológicos, los mecanismos neurales que controlan estos comportamientos defensivos pueden volverse hipersensibles, lo que provoca una tos seca crónica que afecta gravemente a la calidad de vida. Aunque la tos es un motivo frecuente por el que los pacientes buscan ayuda médica, los tratamientos actuales siguen siendo limitados y pueden conducir al abuso de fármacos, en gran parte debido a una comprensión insuficiente de los mecanismos neurales y moleculares que subyacen al comportamiento de la tos.

Un estudio pionero dirigido por el equipo del profesor Luo Fujun, del Laboratorio de Guangzhou, publicado en eLife, identificó un circuito del tronco encefálico que controla los comportamientos defensivos de las vías respiratorias similares a la tos en ratones. El primer autor, el profesor Xu Xiaoshan, utilizó un modelo de ratón en movimiento libre para revelar el circuito neural del tronco encefálico que media en los reflejos respiratorios evocados, definiéndolo como una respuesta similar a la tos. Mediante el empleo de múltiples técnicas de mapeo y modulación de circuitos neuronales, el equipo descubrió un papel hasta entonces desconocido del núcleo trigémino espinal caudal (SP5C) en el comportamiento reflejo de la tos.

Este estudio combinó la pletismografía de cuerpo entero (WBP), la grabación de audio y las tecnologías de seguimiento de vídeo desarrolladas por Tow-Int Tech para establecer un paradigma cuantitativo para estudiar el comportamiento de la tos en ratones despiertos. Utilizando ratones transgénicos TRAP2 y fotometría de fibra in vivo, los investigadores demostraron que la actividad neural en SP5C está altamente correlacionada con las respuestas a la tos inducidas por agentes tosedores.

Otros experimentos demostraron que la inhibición de la salida sináptica de SP5C o la supresión de su actividad mediante métodos quimiogenéticos eliminaban eficazmente estos reflejos de la tos. Por el contrario, la estimulación optogenética de las neuronas excitadoras SP5C o de sus proyecciones al grupo respiratorio ventral (VRG) desencadenó comportamientos robustos similares a la tos incluso en ausencia de estímulos de tos.

En particular, el aumento sostenido de la excitabilidad de las neuronas SP5C provocó tos espontánea crónica en ratones. Estos hallazgos proporcionan una fuerte evidencia de la existencia de un circuito del tronco cerebral previamente no identificado (SP5C→VRG) que controla los comportamientos de defensa contra la tos en ratones.

Objetivos de la investigación

Este estudio identificó y validó sistemáticamente el circuito neural central que controla el comportamiento de la tos utilizando un modelo de ratón y varias tecnologías de análisis de circuitos neurales, con un enfoque particular en el papel de SP5C.

Materiales y métodos

Se empleó un enfoque multidisciplinar para analizar el comportamiento de la tos desde las perspectivas del comportamiento, la actividad neural, la conectividad del circuito y la modulación funcional.

3.1 Modelos animales
Se utilizaron ratones transgénicos de tipo salvaje (WT), TRAP2, knockout condicional de neurexina 1/2/3 (Nrxn123 cTKO), VGluT2-IRES-Cre y GAD2-IRES-Cre para manipulaciones específicas de tipo celular.

3.2 Inducción y monitorización de la tos
Estímulos para la tos: Se nebulizaron ácido cítrico (AC), capsaicina y amoníaco (NH₃) para inducir respuestas similares a la tos.
Sistema de monitorización: La pletismografía de cuerpo entero (WBP) registró los cambios en el flujo de aire respiratorio, mientras que los micrófonos y cámaras capturaron los sonidos y movimientos de la tos para el análisis cuantitativo multimodal.
Definición de tos: Un evento similar a la tos se definió por el patrón de flujo de aire trifásico característico de "inspiración-compresión-espiración" en la WBP, acompañado de distintos sonidos de tos.

3.3 Monitorización de la actividad neuronal
Fotometría de fibra in vivo: Se inyectó AAV-GCaMP6s en regiones cerebrales diana (p. ej., SP5C, NTS, VRG) para monitorizar las señales de calcio y evaluar las correlaciones temporales con el comportamiento de la tos.

3.4 Validación de la necesidad
Bloqueo de la salida sináptica: Se inyectó AAV-Cre en SP5C de ratones Nrxn123 cTKO para bloquear condicionalmente la transmisión sináptica.
Inhibición quimiogenética: Se inyectó AAV-hM4Di-mCherry en SP5C y se administró descloroclozapina (DCZ) por vía intraperitoneal para inhibir la actividad neuronal.

3.5 Validación de la suficiencia
Activación optogenética: Se inyectó AAV-ChrimsonR en SP5C para estimular neuronas excitadoras (CaMKII+). La activación específica de la proyección se consiguió inyectando AAV-Cre en SP5C y AAV-DIO-ChrimsonR en VRG.

3.6 Trazado de circuitos
Trazado trans-sináptico anterógrado y retrógrado:
Anterógrado: Se inyectó AAV-hSyn-EGFP en SP5C para visualizar las proyecciones axonales.
Retrógrado: Se inyectó el virus de la pseudorabia (RV) en VRG para etiquetar las neuronas monosinápticas de entrada de SP5C.
Estrategia de doble virus: Se utilizaron AAV2/1-Cre (anterógrado) y AAV2/9-DIO-Chrimson-mCherry para confirmar las conexiones sinápticas directas entre SP5C y VRG.

3.7 Modelo de tos crónica
NaChBac, un canal de sodio bacteriano activado por voltaje, se sobreexpresó en SP5C para aumentar la excitabilidad neuronal e inducir la tos espontánea.

3.8 Registro electrofisiológico
Se realizaron grabaciones con patch-clamp de células enteras en cortes agudos de tronco cerebral para examinar las propiedades neuronales de SP5C (por ejemplo, disparo del potencial de acción, resistencia de la membrana).

Resultados

4.1 Establecimiento y validación del modelo de comportamiento de la tos
El NH₃, la CA y la capsaicina indujeron respuestas típicas similares a la tos, caracterizadas por el patrón trifásico del flujo de aire y distintos sonidos de tos. Se seleccionó NH₃ como estímulo tosígeno primario debido a sus efectos fuertes y consistentes.

Los tratamientos de control (solución salina) produjeron una tos insignificante, lo que confirma la especificidad del modelo.

4.2 La actividad neuronal de SP5C está altamente correlacionada con la tos
El marcaje TRAP2 mostró que la estimulación con NH₃ activaba neuronas en SP5C, NTS y VRG. La fotometría de fibra confirmó que las señales de calcio de SP5C aumentaban significativamente durante los eventos de tos y estaban sincronizadas con el tiempo de tos.

4.3 La SP5C es necesaria para el reflejo de la tos
El bloqueo de la salida sináptica en SP5C de ratones Nrxn123 cTKO redujo significativamente la tos inducida por NH₃. La inhibición quimiogenética de las neuronas SP5C suprimió fuertemente las respuestas a la tos, mientras que los controles no se vieron afectados.

4.4 La activación de SP5C desencadena directamente la tos
La activación optogenética de las neuronas VGluT2+ o GAD2+ sólo alteró el ritmo respiratorio sin inducir tos. Por el contrario, la estimulación de las neuronas excitadoras CaMKII+ en SP5C desencadenó comportamientos robustos similares a la tos sin estímulos tusivos.

4.5 SP5C regula la tos mediante proyecciones directas a VRG
Los experimentos de rastreo revelaron proyecciones directas de SP5C a cVRG, rVRG y preBötC. El rastreo viral retrógrado confirmó conexiones monosinápticas entre SP5C y VRG. La activación optogenética de las proyecciones SP5C→VRG indujo la tos, siendo más eficaz la estimulación de alta frecuencia.

4.6 La excitabilidad aumentada de SP5C induce tos espontánea crónica
La sobreexpresión de NaChBac en SP5C provocó tos espontánea en 3-4 días, y la frecuencia aumentó con el tiempo. Estos ratones también mostraron una mayor sensibilidad al NH₃, con respuestas a la tos más fuertes y rápidas. Los registros electrofisiológicos confirmaron una mayor excitabilidad y potenciales de acción espontáneos en las neuronas SP5C.

Conclusión

Este estudio identificó y validó sistemáticamente el circuito neural central que controla el comportamiento de la tos en ratones, destacando el papel crítico de SP5C.

Los hallazgos clave incluyen:
- **SP5C es un núcleo central clave para el reflejo de la tos**: Su actividad neuronal está sincronizada con la tos, su inhibición elimina la tos y su activación la desencadena.
- **SP5C regula directamente VRG a través de conexiones monosinápticas**: Esta vía constituye la base neural de la producción motora de la tos.
- **La hiperexcitabilidad de SP5C provoca tos crónica**: El aumento de la excitabilidad neuronal de SP5C induce tos espontánea e hipersensibilidad a la tos, lo que permite comprender mejor los mecanismos de la tos crónica.
- **Los ratones son un modelo válido para estudiar los mecanismos neuronales de la tos**: Las tecnologías multimodales confirman la fiabilidad del comportamiento de los ratones similar a la tos, lo que respalda el uso de ratones en la investigación de circuitos neuronales.

**Importancia y perspectivas
Este estudio revela un centro regulador de la tos (SP5C) que hasta ahora se había pasado por alto y ofrece nuevos conocimientos mecanísticos sobre la tos crónica y la hipersensibilidad a la tos. Puede allanar el camino para el desarrollo de terapias antitusivas centralmente dirigidas.

【Reference】

Xu X, Nie X, Zhang W, et al. Un circuito del tronco cerebral controla los comportamientos defensivos de las vías respiratorias similares a la tos en ratones. *bioRxiv*, 2024: 2024.09.08.611924.