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Extracción y purificación del ácido nucleico

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Extracción y purificación del ácido nucleico

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1. Introducción a la extracción y purificación de ácidos nucleicos

La extracción de ácido nucleico es una parte básica de la biología molecular, ya que un ácido nucleico de alta calidad es esencial para las aplicaciones de biología molecular.

Resumiremos algunas de las técnicas de extracción de ácidos nucleicos utilizadas actualmente y consejos para elegir el método de extracción correcto para el tipo de muestra; también mencionaremos la evaluación de la concentración y la calidad del ácido nucleico, así como los problemas comunes en el proceso de extracción de ácidos nucleicos.

a. ¿Por qué es necesaria la extracción de ácidos nucleicos?

La extracción de ácidos nucleicos da respuesta a un gran número de investigaciones y aplicaciones extensas (por ejemplo: clonación, qRT-PCR y tecnología de secuenciación de próxima generación en el campo del genoma completo y el transcriptoma), y el ácido nucleico obtenido puede utilizarse de diversas maneras.

El propósito exacto de la investigación determina el tipo de ácido nucleico que debe extraerse; la aplicación del ácido nucleico suele afectar a la elección del método de extracción. (Por ejemplo: la reacción de PCR de punto final estándar no requiere la misma calidad de ADN que un experimento de secuenciación del genoma completo)

Para determinar el método de investigación, es necesario conocer claramente las aplicaciones posteriores de los ácidos nucleicos y las posibles limitaciones relacionadas con el tipo de muestra. (Por ejemplo, la recogida de muestras clínicas suele ser limitada, y la extracción de ácidos nucleicos presenta desafíos)

Aunque el método de lisis celular es diferente según el tipo de muestra, el principio básico de la extracción general de ácidos nucleicos sigue siendo el mismo: las muestras de células o tejidos se lisan para eliminar los contaminantes no nucleicos (por ejemplo, las proteínas, etc.).

Razones para extraer el ácido nucleico:

①Para analizar la expresión génica en la investigación básica y en la investigación de enfermedades;

②Seguir la respuesta al tratamiento farmacológico (por ejemplo, controlar el título del virus durante y después del tratamiento antiviral).

③Identificar nuevas especies y conocer el proceso evolutivo (por ejemplo, análisis del ADN antiguo).

④Monitorear y clasificar patógenos que causan brotes de enfermedades infecciosas en humanos, animales y plantas.

⑤ Supervisar la seguridad de los alimentos y del agua mediante pruebas microbiológicas y controles cuantitativos.

⑥Diagnosticar enfermedades (como enfermedades genéticas, cáncer, defectos inmunológicos).

b. Método de lisis celular

La lisis celular depende en gran medida del tipo de muestra, y los tejidos más resistentes, como las plantas, requieren más fuerza para su procesamiento que los mamíferos.

Los métodos de lisis celular se dividen en tres categorías: lisis mecánica, lisis enzimática y lisis química.

Los principios básicos de los tres métodos de análisis y las ventajas y desventajas de cada método son los siguientes:

Método 1: Lisis mecánica

Lisis mecánica: La membrana celular se destruye mediante una fuerza externa.

Ventaja:

Alta eficiencia y rápida velocidad;

La lisis rápida acorta el tiempo desde la recogida de la muestra hasta el aislamiento del ácido nucleico, lo que puede ser crucial en los experimentos de análisis de la expresión génica;

Ideal para muestras difíciles de disolver (por ejemplo, material vegetal, hongos filamentosos y levaduras).

Desventajas:

Dependiendo del método utilizado, el procesamiento de múltiples muestras requiere mucho tiempo (por ejemplo, el procesamiento manual de la molienda);

El procesamiento de un gran número de muestras requiere mucho tiempo y puede aumentar el riesgo de degradación de la muestra;

El procesamiento mecánico generará calor en la muestra, lo que provocará la agregación de proteínas y la degradación de los ácidos nucleicos; l requiere algunas herramientas o equipos especiales.

Método 2: Lisis enzimática

Añadir una enzima para digerir proteínas o estructuras celulares, como las paredes celulares de las levaduras y los hongos filamentosos.

Ventaja:

Es el método ideal en el laboratorio, sin necesidad de equipos de craqueo mecánico en el proceso;

Eliminar selectivamente la pared celular, dejando la parte de la célula para utilizar otro método de lisis (generalmente lisis química), el método es flexible, y se evitan algunos daños causados por la lisis mecánica.

Desventajas:

Consume mucho tiempo (la digestión enzimática puede durar 1 hora) y es cara;

Debido a que los cambios celulares inducidos por la enzima pueden afectar a la expresión genética, no es adecuado para el análisis de la expresión genética.

Método 3: Lisis química

En el proceso de descomposición química, las células se lavan con un detergente que puede romper las membranas lipídicas, liberando así los componentes celulares. Además de los detergentes, los tampones de lisis química suelen contener sales caotrópicas, como el clorhidrato de guanidina o la urea, que ayudan a degradar la estabilidad de las proteínas de los ácidos nucleicos recién expuestos (como las nucleasas) y a unir los ácidos nucleicos a la matriz de sílice. La composición exacta del tampón de lisis química depende del sentido de la aplicación y del tipo de muestra.

Ventaja:

El precio es barato, el funcionamiento es sencillo y la velocidad es rápida; no se requiere ningún equipo especial.

Desventajas:

Los detergentes que destruyen las membranas celulares suelen disolver también otras membranas celulares, liberando así sus componentes. Este método no es adecuado para la extracción de ácidos nucleicos específicos de un orgánulo;

Aunque esta tecnología es eficaz contra E. coli, no lo es contra las bacterias Gram-positivas, las células vegetales o las células fúngicas, debido a la dureza de la pared celular que impide que el detergente entre en la membrana celular;

La adición de detergente y sal caotrópica a las muestras de E. coli al mismo tiempo puede afectar a la capacidad de distinción del ADN plasmídico y el ADN genómico. Sin embargo, se pueden tomar medidas para distinguir estos tipos, que se discutirán más adelante.

Las sustancias químicas pueden ser peligrosas para los investigadores.

c. Comprensión de los principios de la purificación de ácidos nucleicos

Una vez lisada la célula, el ácido nucleico se libera selectivamente de los componentes celulares circundantes y se concentra en una solución acuosa o en una solución tampón adecuada para su posterior uso. Los pasos posteriores a la comprensión celular se denominan colectivamente purificación. Dado que las propiedades químicas del ácido nucleico aislado permanecen inalteradas, independientemente del tipo de muestra, la estrategia de purificación descrita a continuación es generalmente aplicable a todos los tipos de muestras.

① Columnas de centrifugado

Este método suele estar estrechamente relacionado con el kit. La extracción y purificación con columna de centrifugado puede obtener rápidamente ADN, plásmidos, ARN y productos de PCR de alta calidad sin necesidad de preparar reactivos frescos. La columna de centrifugado contiene una matriz sólida de gel de sílice o resina patentada para la unión selectiva de ácidos nucleicos.

Pasos típicos de la operación de extracción con columna de centrifugado:

A. Mantener la muestra lisada en la columna de centrifugado:

La muestra lisada se recoge en un tampón de unión que contiene sales caotrópicas y se coloca en una columna de centrifugado. El tampón de unión permite que el ácido nucleico se separe de la solución acuosa y se una a la matriz de la columna.

B. Unión del ácido nucleico:

La centrifugación pone en contacto toda la muestra con la matriz de la columna. Los ácidos nucleicos de la muestra se unen selectivamente a la columna, mientras que otros componentes celulares atraviesan (lo que comúnmente se denomina flujo a través) la matriz de la columna.

C. Lavado:

Tras la unión, la columna se limpia para eliminar cualquier contaminante residual, como proteínas o sales residuales, que puedan afectar seriamente a las aplicaciones posteriores. El número de lavados depende del kit. Algunos tampones de lavado contienen sales caotrópicas para eliminar las proteínas, y algunos tampones contienen altas concentraciones de etanol para eliminar las sales. La mayoría de los kits incluyen casi en su totalidad un tampón compuesto por etanol como paso de lavado para garantizar una desalinización completa.

D. Eliminación del etanol residual de la columna de centrifugado:

Después del lavado, a veces se realiza un breve período de centrifugación en vacío para eliminar el etanol residual.

E. Elución:

Para eluir los ácidos nucleicos de la matriz, se añade una pequeña cantidad de agua o tampón de elución*, y se deja reposar la columna durante unos minutos. Desde el paso anterior, se ha eliminado la sal caotrópica, y el tampón de elución puede rehidratar el ácido nucleico y separarlo de la matriz de la columna. Una centrifugación puede transferir la solución acuosa que contiene la muestra de ácido nucleico a un nuevo tubo de centrífuga.

*Los ácidos nucleicos suelen almacenarse en un tampón que contiene Tris y EDTA (tampón TE). La presencia de EDTA ayuda a inhibir la actividad de las nucleasas. Aunque el tampón TE es eficaz para inhibir las nucleasas, el contenido de EDTA en el TE suele ser varios órdenes de magnitud inferior a la mayoría del contenido de Mg2+.

Ventajas y desventajas de las columnas de centrifugado

Ventajas:

bajo coste

Eficacia y fiabilidad

Producen ácidos nucleicos adecuados para aplicaciones posteriores

Desventajas:

Las cepas de crecimiento lento tienen bajos niveles de ácido nucleico

La elución incompleta provoca la pérdida de ácido nucleico

La capacidad de unión de la columna de centrifugación determina la cantidad total de ácido nucleico

Kit de columna de centrifugado de plásmidos

Los kits de extracción de plásmidos pueden aislar rápidamente los plásmidos de E. coli y son uno de los kits más utilizados en los laboratorios de biología molecular.

Dado que E. coli es fácil de lisar químicamente, el kit de plásmidos combina la lisis de la muestra y la purificación del ácido nucleico de la siguiente manera:

A. Las células bacterianas se lisan en un tubo de centrífuga antes de centrifugar y precipitar los restos celulares;

B. La configuración del tampón de lisis es tal que sólo el ADN plasmídico puede combinarse con la columna de centrifugado después de la lisis. Por lo tanto, el lisado celular puede montarse inmediatamente en la columna por centrifugación.

C. Combinar el plásmido que contiene el lisado con la columna de centrifugado, y los pasos de purificación restantes son similares a todos los demás esquemas de columna de centrifugado.

D. Utilice el ADN plasmídico de alta calidad para la elución en agua o tampón TE.

**La mayoría de los kits de columnas de centrifugación distinguen el ADN plasmídico del ADN genómico (ADNg) durante el proceso de lisis. El tampón de lisis contiene hidróxido de sodio y lauril sulfato de sodio para desnaturalizar completamente el plásmido y el ADNg. En el siguiente paso, la muestra se neutraliza y el ADN plasmídico renace. Sin embargo, el ADNg de alto peso molecular no puede recombinarse por completo y se enreda fácilmente con la proteína de la muestra, impidiendo así que el ADNg se una a la columna de centrifugado, lo que conduce a su eliminación. Aunque en términos de eficiencia y fiabilidad, los kits de columnas de centrifugado de plásmidos tienen algunas deficiencias. El estándar de optimización del kit es principalmente a través de cepas de Escherichia coli, las cepas lentas o inestables pueden tener bajos rendimientos. Además, los kits de plásmidos y los kits de columnas de centrifugado tienen una capacidad de unión limitada. Dependiendo del kit, la tasa de recuperación total está entre 50 y 100 μg.

Otros kits de columnas de centrifugado

Además de la extracción de ácidos nucleicos, las columnas de centrifugado también se utilizan para la purificación y concentración de ácidos nucleicos. Los kits de purificación pueden utilizarse para eliminar los reactivos residuales que no han reaccionado en la PCR u otras reacciones de preparación enzimática, y para purificar el ADN de los geles de agarosa. Las muestras concentradas pueden proporcionar una mayor flexibilidad para muchas aplicaciones posteriores.

Algunos kits comerciales de columnas de centrifugación tienen la función de cribado de fragmentos, lo que permite la selección de kits de rangos de fragmentos adecuados (por ejemplo, ARN pequeño) según el propósito de la investigación. Esto se consigue cambiando el contenido de etanol en la solución tampón.

Muchos kits de columnas de centrifugación combinan la lisis celular y la purificación de ácidos nucleicos. Podemos encontrar columnas de centrifugación para la separación de ácidos nucleicos a partir de casi cualquier tipo de muestra, incluyendo, entre otras, insectos, plantas, semillas, hongos, bacterias, saliva, sangre, heces y muestras embebidas en parafina.

② Precipitación con fenol/cloroformo y etanol

El método de extracción con fenol/cloroformo es un método que se basa en el principio de la diferente solubilidad para separar los ácidos nucleicos. La muestra se expone a una proporción determinada de la mezcla de fenol/cloroformo para obtener el ácido nucleico deseado. La proteína es soluble con fenol/cloroformo, el ácido nucleico es soluble en agua. Cuando la solución de fenol/cloroformo se mezcla con la muestra, la proteína y el ácido nucleico se separan, proporcionando una garantía de purificación.

Para la extracción dual de ARN y ADN, este proceso puede ajustarse añadiendo fenol ácido. Esto permite que el exceso de iones H+ interactúe con la columna vertebral del fosfato, dando como resultado un ADN sin carga. El ADN se disolverá en la capa de fenol extraída por el fenol/cloroformo, mientras que el ARN permanecerá disuelto en la fase acuosa debido a su acidez natural. Después de la centrifugación, se pueden separar las fases acuosa y orgánica, y cada fase puede ser precipitada con etanol.

Pasos de funcionamiento de la precipitación clásica con fenol/cloroformo y etanol:

A. Contacto de fenol y cloroformo:

La muestra lisada se suele mezclar con el fenol/cloroformo mediante un fuerte vórtex. El vórtice asegura que todos los componentes orgánicos puedan interactuar completamente con la mezcla de fenol/cloroformo para lograr una completa disolución y eliminación.

B. Centrifugación: Después del paso A, se ven dos fases. La fase acuosa que contiene los ácidos nucleicos está en la parte superior, mientras que la fase orgánica del fondo contiene proteínas, lípidos y otras macromoléculas. A continuación, se centrifuga la muestra para separar completamente las dos fases

C. Separación de las fases: retirar cuidadosamente la fase acuosa con una pipeta.

D. Precipitación con etanol: precipitación y purificación del ácido nucleico con etanol. Durante el proceso de precipitación con etanol, se añaden sal y etanol para amortiguar el ácido nucleico en la solución acuosa. La sal amortigua la espina dorsal del fosfato de azúcar, y el etanol cambia la constante dieléctrica de la solución. Esto permite separar el ácido nucleico de la solución acuosa, que puede separarse por centrifugación de alta velocidad.

E. Resuspensión: Volver a disolver el ADN o ARN en un grupo en agua o tampón TE.

Ventajas y desventajas de la extracción con fenol/cloroformo

Ventaja:

Alta eficacia, normalmente superior al rendimiento de la columna de centrifugado; ü Adecuado para extraer ADN completo de alto peso molecular (por ejemplo, ADNg);

Las muestras suspendidas en soluciones complejas suelen seguir siendo adecuadas para este método, y algunos compuestos volátiles pueden interferir con la matriz de la columna de centrifugado;

Para las muestras de grasa (por ejemplo, tejido cerebral), la extracción con fenol/cloroformo es mejor que la mayoría de los kits de columna de centrifugado.

Desventajas:

Si no se manipulan adecuadamente, el fenol y el cloroformo son perjudiciales y deben manipularse con extremo cuidado en una campana de humos.

Este método requiere más tiempo que los kits de columnas de centrifugado y puede dar lugar a rendimientos más bajos.

Las trazas de fenol y cloroformo en el extracto de ácido nucleico tendrán un impacto negativo en las reacciones enzimáticas posteriores, como la PCR. Si este es el caso, es necesario limpiarlo antes de la PCR. Por lo tanto, existen muchos kits de purificación con columna de centrifugado.

Puede ser necesaria un poco de experiencia práctica para extraer con seguridad la fase acuosa libre de contaminantes.

③Métodos automáticos para aumentar el rendimiento

Según las diferentes aplicaciones de ácidos nucleicos y los tipos de muestras, se pueden seleccionar los métodos de extracción de alto rendimiento adecuados. El más utilizado es la extracción con perlas magnéticas. En esta técnica, se introducen perlas magnéticas con carga positiva en la muestra, y el ADN se combina con las perlas magnéticas con carga positiva a pH bajo, y el ADN se libera a pH alto. Las perlas se pueden retirar con un imán, y el pH de la solución se puede ajustar fácilmente para separar el ácido nucleico deseado. Esta tecnología es rápida y eficaz, pero la inversión en equipos de automatización puede ser bastante cara. (El material de revestimiento de las perlas magnéticas es diferente, y el principio es ligeramente distinto)

d. Factores clave y su impacto en la extracción

Al realizar la extracción o purificación de ácidos nucleicos, hay que prestar mucha atención a algunos factores, como el pH, la concentración de sal, la temperatura, el volumen de tampón y la posible contaminación por etanol. Cada uno de estos factores afectará en gran medida al rendimiento, la calidad y la tasa de éxito de los experimentos posteriores.

1. Un pH o una concentración de sal no óptimos pueden cambiar la carga del ácido nucleico, haciendo que éste no se una a la columna de centrifugado, o haciendo que el fenol/cloroformo disuelva el ácido nucleico por error.

2. Un volumen de tampón incorrecto puede provocar una lisis incompleta, una neutralización o una dilución indirecta del ácido nucleico eluido.

3. La contaminación por etanol puede inhibir las reacciones enzimáticas posteriores y hacer que la muestra flote fuera del gel de agarosa.

e. Circunstancias especiales

1. Extracción de ADN de alto peso molecular

Para algunas aplicaciones (como la hibridación Southern y algunos procesos de secuenciación), es necesario extraer ADN intacto de alto peso molecular (HMW). Para extraer ADN de alto peso molecular, además de los factores mencionados anteriormente, es necesario tener en cuenta otros factores:

El ADN HMW se rompe fácilmente durante el proceso de extracción. Porque las fuerzas de cizallamiento (vórtice, ultrasonido, etc.) pueden provocar la descomposición de las moléculas de ADN, lo que da lugar a fragmentos más cortos después de la extracción. Para evitarlo, aplique un cizallamiento mínimo a la muestra.

Para las aplicaciones que requieren la visualización del HMWDNA, la lisis y la extracción pueden realizarse en un tapón de gel de agarosa para estabilizar el ADN durante todo el proceso (por ejemplo, electroforesis en gel de campo pulsado), donde todo el cromosoma permanece intacto y se visualiza por electroforesis.

La lisis alcalina a menudo conduce a la pérdida de ADN HMW, porque el ADN HMW se enreda irreversiblemente durante el proceso de desnaturalización.

Si utiliza una columna de centrifugación para extraer el ADN HMW, tenga en cuenta la capacidad de unión de la matriz de la columna. Algunas columnas sólo pueden manejar fragmentos de 10-15 kb de tamaño, ya que los fragmentos más grandes son difíciles de eluir de la columna debido a la estrecha unión. Para fragmentos más grandes, puede ser necesario considerar columnas dedicadas con alta unión HMW, o métodos manuales como la extracción con fenol/cloroformo y la precipitación con etanol.

2.SmallRNAs

En el proceso tradicional de extracción de ARN, las pequeñas moléculas de ARN suelen perderse, ya que las columnas de centrifugado tradicionales suelen tener un límite de tamaño de unos 100 pares de bases, aunque el límite de tamaño depende en gran medida de la formulación del tampón. Las moléculas de ARN pequeñas son extremadamente importantes para comprender las funciones biológicas, por lo que la mayoría de los kits de extracción y purificación de ARN total están optimizados para capturar estos ARN pequeños.

2. Evaluar el ácido nucleico extraído

a. Cuantificación y control de calidad

Tras la extracción y purificación del ácido nucleico, es muy importante conocer la concentración y la calidad de la muestra extraída. Dependiendo del objetivo del experimento posterior, las fluctuaciones de estos parámetros pueden cambiar en gran medida los resultados. Por ejemplo, si cada reacción de síntesis de ADNc no utiliza exactamente el mismo ARN total, el análisis de expresión por qRT-PCR dará lugar a datos poco fiables. Existen muchos métodos de evaluación de ácidos nucleicos, que difieren en cuanto a consumo de tiempo, coste y precisión. Por último, al seleccionar los métodos deben tenerse en cuenta los requisitos de los experimentos posteriores.

A continuación se ofrece una visión general de algunos de los métodos de evaluación más comunes:

1. electroforesis en gel de agarosa

La electroforesis en gel de agarosa se basa en el peso molecular y separa los ácidos nucleicos a través de una matriz de gel solidificada en presencia de una corriente eléctrica. El ácido nucleico extraído se compara con un estándar de peso molecular paralelo, que contiene fragmentos de tamaño y concentración conocidos.

Ventajas: inspeccionar visualmente la calidad del ADN; las muestras de ADN genómico completo se muestran como bandas completas; los ácidos nucleicos degradados se muestran como difusos; el ARN ribosómico es claramente visible; disponible para la mayoría de los laboratorios; visualización de posibles contaminaciones (por ejemplo, muestras de purificación de plásmidos en las que hay ARN).

Desventajas: Sólo se proporciona una estimación aproximada de la concentración; no muestra la presencia de contaminantes, como la sal, en la muestra.

2. Electroforesis capilar

La electroforesis capilar, a veces denominada "laboratorio en un chip", extrae muestras a través de un pequeño capilar supervisado por un detector, y el ordenador recibe la información y la muestra gráficamente. La electroforesis capilar es adecuada para analizar el tamaño de los fragmentos, la cantidad y la calidad general de la muestra. Esta técnica es más precisa que la electroforesis de agarosa tradicional, y suele ser un método de evaluación de ácidos nucleicos antes de la qPCR.

Ventajas: análisis preciso de múltiples tipos de ácidos nucleicos; la carga automática de la muestra y la cuantificación son más precisas que el método del gel; alta sensibilidad: se pueden detectar y analizar muestras pequeñas y de tamaño reducido.

Desventajas: es caro.

3. Espectrofotometría

La espectrofotometría es una técnica de detección rápida que se basa en las características de la luz que interactúa con la muestra para una cuantificación precisa. La muestra se carga en el instrumento de prueba (espectrofotómetro) con diferentes longitudes de onda de luz que pasan a través de ellos, y luego es recibida por el detector. El detector proporciona información sobre la cantidad y la calidad de la muestra, que luego es traducida por el software del ordenador. Al medir la absorbencia a 260 nm y 280 nm, la relación de ambas indica la pureza de la muestra. Para el ADN y el ARN puros, la relación 260/280 debe estar entre 1,8 y 2,1. Se pueden realizar mediciones adicionales a 230 nm, y una relación 230/280 nm inferior a 2,0 indica la presencia de contaminantes orgánicos.

En los últimos años, un nuevo tipo de método de análisis espectrofotométrico basado en la fluorescencia ha sido ampliamente utilizado en los laboratorios de biología molecular. Esta tecnología basada en la fluorescencia tiene una mayor sensibilidad que la espectrofotometría tradicional, y puede distinguir el ADN y el ARN mediante el uso de tintes fluorescentes únicos para el ADN y el ARN.

Ventajas: es precisa y rápida; proporciona información sobre la presencia de contaminantes; la mayoría de los laboratorios disponen de espectrofotómetros.

Desventajas: Imposibilidad de cuantificar un solo segmento; caro.

b. Mejorar la calidad del ácido nucleico

A pesar de nuestros grandes esfuerzos, suele ser necesario tomar medidas adicionales para mejorar la calidad de los ácidos nucleicos. A continuación se describen algunos factores adicionales que hay que tener en cuenta para mejorar la calidad de los ácidos nucleicos.

1. Temperatura de uso y almacenamiento:

Los ácidos nucleicos son fácilmente degradados por las nucleasas (concretamente la RNasa y la DNasa), y el almacenamiento a baja temperatura puede ayudar a inhibir la actividad de las enzimas. El ADN es intrínsecamente más estable que el ARN y es más resistente a la actividad de las nucleasas a temperaturas de almacenamiento más altas.

El ADN debe almacenarse a -20°C o menos, y mantenerse en hielo durante su uso. La congelación y descongelación repetidas pueden fragmentar el ADN, especialmente el ADN HMW. Por lo tanto, si el HMW-DNA se utiliza con frecuencia, debe almacenarse a 4°C.

El ARN se degrada más fácilmente por las nucleasas y debe almacenarse siempre a una temperatura muy baja (de -20 a -80°C), y sólo descongelarse cuando sea necesario.

2. Inhibidor de nucleasas y solución de limpieza

La presencia de nucleasas puede degradar rápidamente las muestras de ácidos nucleicos. Es fácil transferir nucleasas de las manos desprotegidas a la superficie de trabajo; por lo tanto, siempre debe usar guantes cuando trabaje con ácidos nucleicos.

El lugar de trabajo debe mantenerse limpio y limpiarse frecuentemente con etanol para eliminar la contaminación por nucleasas. Hay muchos productos comerciales que pueden prevenir la contaminación por RNasa. Muchos investigadores también añaden al agua el inhibidor de ribonucleasas pirocarbonato de dietilo (DEPC) para trabajar con ARN. También es aconsejable lavar y tratar la cristalería con EDPC antes de trabajar con el ARN.

En los últimos años, han aparecido en el mercado muchos estabilizadores de ácidos nucleicos. A diferencia de las soluciones de limpieza descritas anteriormente, estos reactivos se añaden directamente a la muestra intacta en el punto de recogida para inhibir las nucleasas y estabilizar los ácidos nucleicos hasta la extracción. Aunque la mayoría de estos reactivos son compatibles con la mayoría de los kits y aplicaciones de extracción posteriores, algunos de ellos deben eliminarse de las muestras intactas antes de la extracción de ácidos nucleicos.

3. Utilice consumibles libres de nucleasas

Cuando utilice cualquier ácido nucleico, asegúrese de no utilizar nucleasas en los consumibles o el material de vidrio. Siempre que sea posible, compre tubos libres de nucleasas y puntas de pipeta con filtro. Si después del análisis, descubre que su rendimiento de ADN es bajo y la calidad no es la ideal, o si el ADN extraído pasa su evaluación de calidad pero obtiene resultados insatisfactorios durante el experimento posterior, necesita hacer algo para solucionar el problema.