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Secuenciar mientras se sintetiza
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el principio básico de la NGS
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La NGS es el proceso de fragmentación y empalme aleatorio del ADN para preparar una biblioteca de secuenciación. Al realizar reacciones de extensión en las decenas de miles de clones de la biblioteca, se detectan las señales correspondientes y se obtiene finalmente la información de la secuencia.
El principio básico de la NGS es secuenciar mientras se sintetiza, como se analiza a continuación.
Ciclo 1: Añadir el sistema de reacción
Incorporar una base
Eliminar otros nucleótidos no incorporados
Detección de la señal
Ciclo 2 - n: Añadir el sistema de reacción, repetir el ciclo 1
11. En cada ronda de reacciones de secuenciación se añaden cuatro NTPs marcados con fluorescencia.
terminados con un grupo protector que puede ser eliminado.
2. Sólo se integra un nucleótido en cada ronda de reacción y el instrumento lee la señal de fluorescencia correspondiente.
3. Al final de la lectura de la señal, se eliminan químicamente los grupos de bloqueo y fluorescencia para la siguiente ronda de reacciones de secuenciación.
Actualmente, Illumina es una de las empresas más utilizadas en el mercado, y la biblioteca preparada se une a un chip especial "Flowcell" por el principio de emparejamiento de bases complementarias, en los siguientes pasos:
I. Flowcell 8 carriles, superficie interior → modificada químicamente → 2 cebadores de ADN → complementarios a la secuencia de empalme de la biblioteca de ADN que se va a secuenciar → unidos covalentemente al Flowcell para evitar que sea arrastrado por el líquido
II. Biblioteca de ADN: muchos fragmentos de ADN, unidos en ambos extremos con una unión específica de ADN para formar una mezcla de ADN → dos características, método de producción → ultrasonido para interrumpir el ADN genómico, ambos extremos con enzimas para rellenar, usando la enzima Klenow para añadir una base A en el extremo 3', y luego ligasa para unir la unión → formar una biblioteca → mezcla de ADN
III. PCR en puente: sembrar la biblioteca en el chip → hibridación complementaria (las secuencias de ADN de ambos extremos de la biblioteca son complementarias a los cebadores en el chip) → añadir dNTPs y enzimas → generar una nueva hebra → añadir solución alcalina de NaOH → hebra de ADN no trenzada → dejar la hebra original → añadir líquido neutro para neutralizar la solución alcalina → el otro extremo del ADN se hibrida complementariamente con el segundo cebador en la placa de vidrio → añadir enzimas y dNTPs → añadir álcali → añadir líquido neutro → repetir el proceso para la amplificación
IV. Transformar la cadena doble sintetizada en una cadena única que pueda ser secuenciada → reacción química → cortar un grupo específico de un cebador → la solución alcalina lava la cadena restante del chip → añadir solución neutra con el cebador de secuenciación (con dNTP marcado con fluorescencia → el extremo 3' está bloqueado por un grupo azida → un ciclo sólo puede extender una base, polimerasa → seleccionar el dNTP complementario a la base en la posición original) → eliminar el exceso de dNTP y enzimas mediante agua → poner la base en el microscopio para el escaneo láser → determinar el tipo de base (4 dNTPs) según la fluorescencia emitida → añadir reactivos químicos para cortar el grupo azida y el grupo fluorescente etiquetado al lado → exponer el grupo hidroxilo en el extremo 3' → añadir nuevos dNTPs y nuevas enzimas → extender una base de nuevo → eliminar el exceso de enzimas y dNTPs → leer el color en el escaneo láser → repetir el proceso
V. Índice: Marca en la unión de la biblioteca; la secuencia específica en la unión específica de la muestra marca el origen de la misma
VI. Índice de lectura: ADN read1 no trenzado con álcali → añadir solución neutra → añadir cebador de secuenciación read2 (sitio de unión junto a la secuencia índice) → realizar 2 rondas de secuenciación (generalmente de 6 a 8 bases) → comprender un segmento específico de ADN de qué muestra del original
VII. Secuenciación de doble extremo: una hebra de ADN se lee una vez en ambas direcciones, hacia adelante y hacia atrás, duplicando la longitud efectiva de la secuenciación
VIII. Hebra invertida: sintetizar la hebra complementaria de ADN → cortar la raíz de la hebra original con reactivos químicos → hebra complementaria restante → realizar una segunda secuenciación (añadir cebadores read3 para leer bases)