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El tratamiento con electroacupuntura alivia con éxito los síntomas de la EPOC en modelos experimentales de rata

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potencial como tratamiento complementario de la EPOC en el futuro

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La enfermedad pulmonar obstructiva crónica (EPOC) es la tercera causa de muerte en todo el mundo, y los tratamientos farmacológicos actuales están asociados a efectos secundarios. Recientemente, los investigadores Lu Liu, Zili Tang y sus colegas publicaron un estudio titulado "Transcriptomic Insights into Different Stimulation Intensity of Electroacupuncture in Treating COPD in Rat Models" en la revista Journal of Inflammation Research.

Este estudio tenía como objetivo investigar los efectos terapéuticos y los mecanismos moleculares de la electroacupuntura a intensidades de 1mA y 3mA en la EPOC en modelos de rata. Mediante el establecimiento de modelos, la agrupación de tratamientos, la detección multiparamétrica y el análisis ómico, los investigadores descubrieron que ambas intensidades mejoraban la función pulmonar, pero los patrones de expresión génica variaban. Identificaron ocho genes candidatos y vías relacionadas, proporcionando nuevos objetivos y conocimientos para el tratamiento de la EPOC con electroacupuntura.

1. Antecedentes de la investigación

La enfermedad pulmonar obstructiva crónica (EPOC) se caracteriza por inflamación crónica, destrucción alveolar y obstrucción de las vías respiratorias pequeñas, y es la tercera causa de muerte en todo el mundo. Los tratamientos farmacológicos actuales están asociados a efectos secundarios, mientras que la electroacupuntura (EA) ha demostrado cierta eficacia en el tratamiento clínico. Sin embargo, la intensidad de la estimulación sigue sin estar estandarizada. El objetivo de este estudio es comparar los efectos terapéuticos y los mecanismos de la electroacupuntura de 1mA y 3mA en la EPOC en modelos de rata y revelar los mecanismos de regulación molecular a través del análisis transcriptómico.

2. Métodos experimentales

2.1 Animales experimentales y agrupación

Selección de animales: Ratas macho Sprague-Dawley de 12-14 semanas de edad.

Agrupación de los animales: Las ratas se dividieron aleatoriamente en cuatro grupos, cada uno de los cuales constaba de seis animales: grupo de control normal (NC), grupo EPOC, grupo EPOC+1mA-EA (EA-1mA) y grupo EPOC+3mA-EA (EA-3mA).

2.2 Establecimiento del modelo de EPOC y tratamiento con electroacupuntura

Establecimiento del modelo: El modelo de EPOC se indujo mediante una combinación de tabaquismo pasivo (TS) e inyección intratraqueal de lipopolisacárido (LPS). Se expuso a las ratas al humo del tabaco en un sistema de exposición de todo el cuerpo durante 2 horas diarias a lo largo de 12 semanas, y se les administraron inyecciones de LPS los días 1, 31 y 61.

Tratamiento de electroacupuntura: A partir del día 77, se realizó EA a las ratas de los grupos EA-1mA y EA-3mA durante 20 minutos diarios a lo largo de dos semanas. Se seleccionaron los acupuntos BL13 (Feishu) y ST36 (Zusanli), con profundidades de inserción de la aguja de 6 mm y 7 mm, respectivamente. Se aplicaron ondas dispersas-densas con una frecuencia de 4/20Hz e intensidades de 1mA y 3mA. Las ratas de los grupos NC y EPOC fueron anestesiadas sin EA.

2.3 Indicadores de evaluación

Evaluación de la función pulmonar: Los parámetros de la función pulmonar, incluidos el volumen espiratorio forzado (VEF), la capacidad vital forzada (CVF) y la relación VEF/CVF, se midieron utilizando un sistema de pruebas de la función pulmonar para animales de experimentación.

Examen histopatológico: La morfología del tejido pulmonar se evaluó mediante tinción con hematoxilina y eosina (HE), y la infiltración inflamatoria se detectó mediante tinción inmunohistoquímica (IHC). Se calcularon la relación superficie alveolar/área intersticial (A/S) y la densidad óptica media (DIO/área) de macrófagos y linfocitos T.

Indicadores inflamatorios y de estrés oxidativo: Se midieron los niveles séricos de interleucina-6 (IL-6), interleucina-1β (IL-1β), interleucina-10 (IL-10) y factor de necrosis tumoral-α (TNF-α) mediante un ensayo inmunoenzimático (ELISA). Se utilizaron kits bioquímicos para medir los niveles de superóxido dismutasa (SOD), malondialdehído (MDA) y glutatión peroxidasa (GSH-Px) en suero y tejido pulmonar.

Secuenciación transcriptómica (RNA-Seq) y análisis: Se extrajo ARN total del tejido pulmonar para el análisis RNA-Seq con el fin de identificar genes expresados diferencialmente (DEGs). Se realizaron análisis de ontología génica (GO) y de enriquecimiento de vías de la Enciclopedia de Genes y Genomas de Kioto (KEGG). Se utilizó el análisis de redes de coexpresión génica ponderada (WGCNA) para construir redes de coexpresión génica y determinar la relación entre módulos y rasgos.

Validación mediante RT-qPCR y Western Blot (WB): Los DEG seleccionados se validaron a nivel de ARNm y proteína mediante RT-qPCR y WB, respectivamente.

2.4 Análisis estadístico

Los datos se expresaron como media ± desviación estándar (DE) y se analizaron utilizando el software Prism 9.0. Para los datos con distribución normal y homogeneidad de varianza, se utilizó un análisis de varianza unidireccional (ANOVA), seguido de pruebas t de diferencia mínima significativa (LSD) para las comparaciones por pares. Para los datos no distribuidos normalmente, se aplicó la prueba de Kruskal-Wallis. La significación estadística se fijó en p < 0,05.

3. Resultados experimentales

3.1 Efectos de la electroacupuntura sobre la función pulmonar, la inflamación y el estrés oxidativo en ratas con EPOC

Mejora de la función pulmonar: En comparación con el grupo NC, la relación FEV/FVC en el grupo EPOC se redujo significativamente, lo que indica una limitación grave del flujo aéreo. Los tratamientos con EA-1mA y EA-3mA mejoraron significativamente el cociente, aunque no se observaron diferencias significativas entre los dos grupos de EA.

Cambios histopatológicos:

La tinción HE mostró septos alveolares engrosados, formación de enfisema e infiltración de células inflamatorias en el grupo EPOC. La relación A/S se redujo y el número de células inflamatorias aumentó. El tratamiento con EA-3mA aumentó significativamente la relación A/S, mientras que EA-1mA también mostró una tendencia al aumento, aunque no alcanzó significación estadística. Ambos tratamientos inhibieron la agregación local de células inflamatorias. Los resultados de la tinción IHC fueron coherentes, mostrando una infiltración celular inflamatoria significativa en el grupo EPOC. Tras el tratamiento con EA, se redujo el número de macrófagos y linfocitos T.

Cambios en los factores inflamatorios y los indicadores de estrés oxidativo:

En el grupo EPOC, los niveles séricos de citoquinas proinflamatorias estaban elevados, la actividad de las enzimas antioxidantes estaba reducida y los niveles del producto de la peroxidación lipídica MDA estaban aumentados. El tratamiento con EA-3mA redujo significativamente los niveles de IL-6, IL-1β y TNF-α, al tiempo que aumentó el nivel de IL-10. También aumentó la actividad de la SOD y la actividad de las enzimas antioxidantes. También aumentó la actividad de SOD y GSH-Px en suero y tejido pulmonar, y redujo los niveles de MDA. El tratamiento con EA-1mA tuvo un efecto menor sobre los niveles de citocinas, y sólo se observó cierta mejora en los indicadores antioxidantes en el suero.

3.2 Resultados del análisis transcriptómico

Selección de genes expresados diferencialmente:

El análisis RNA-Seq identificó un total de 1.101 genes expresados diferencialmente (DEGs). La agrupación jerárquica mostró distintos patrones de expresión génica entre el grupo EPOC y el grupo NC, mostrando el grupo EA-3mA una mayor similitud con el grupo NC, mientras que el grupo EA-1mA mostró una mayor divergencia. El análisis del diagrama de Venn reveló que, en comparación con el grupo EPOC, el grupo EA-1mA aumentó la regulación de 94 genes y el grupo EA-3mA aumentó la regulación de 255 genes, con 32 genes solapados. Además, 63 genes regulados al alza en el grupo EPOC en comparación con el grupo NC fueron regulados a la inversa tras el tratamiento con EA. También se identificaron genes específicos que sólo se expresaban en determinados grupos de EA, como Msr1 y Slc26a4, que sólo se regulaban a la baja en el grupo EA-1mA, y Pde3a y Bmp6, que sólo se regulaban al alza en el grupo EA-3mA.

Análisis de anotación funcional:

Los análisis de enriquecimiento de vías GO y KEGG revelaron que los DEG del grupo EPOC estaban principalmente enriquecidos en las cascadas del complemento y la coagulación, el fagosoma, el ritmo circadiano y otras vías. El grupo EA-3mA también mostró un enriquecimiento en estas vías y, además, mostró un enriquecimiento específico en las vías de la sinapsis colinérgica, la sinapsis glutamatérgica y la guía axónica. El grupo EA-1mA, en comparación con el grupo EPOC, enriqueció principalmente las vías asociadas con la inflamación y las respuestas inmunitarias, como la formación de trampas extracelulares de neutrófilos, el fagosoma y las vías de señalización del factor inducible por hipoxia-1 (HIF-1).

3.3 Resultados del análisis WGCNA

El análisis WGCNA dividió los 1.101 DEGs en 5 módulos. El módulo MEblue se correlacionó negativamente con la relación FEV/FVC y los niveles séricos de SOD, y positivamente con los niveles séricos de MDA. Este módulo contenía genes como Aqp9, Trem1, Mrc1 y Gpnmb, que estaban regulados a la baja en ambas intensidades de EA. Los módulos MEblue y MEbrown se correlacionaron negativamente con los niveles séricos de SOD, con Msr1 y Slc26a4 específicamente restaurados en el grupo EA-1mA. El módulo MEturquoise se correlacionó negativamente con los niveles séricos de IL-1β y contenía genes como Pde3a y Bmp6, que fueron específicamente regulados al alza en el grupo EA-3mA. Los resultados de RT-qPCR y WB confirmaron que las tendencias de expresión de estos genes eran coherentes con los resultados de secuenciación.

3.4 Selección y análisis de genes diana

Basándose en el análisis y la revisión de la literatura, se seleccionaron Mrc1, Gpnmb, Trem1 y Aqp9 como genes diana. Estos genes fueron significativamente regulados al alza en el modelo de EPOC y regulados a la baja tras el tratamiento con EA. Pueden participar en la patogénesis de la EPOC modulando la inflamación, el estrés oxidativo y los procesos de remodelación tisular, lo que los convierte en posibles dianas terapéuticas para el tratamiento de la EPOC con EA.

4. Conclusiones de la investigación

Las intensidades de estimulación de electroacupuntura de 1mA y 3mA indujeron diferentes patrones de expresión génica en el modelo de rata con EPOC, implicando vías de enriquecimiento tanto compartidas como específicas. Genes como Mrc1, Gpnmb, Trem1 y Aqp9 pueden servir como potenciales dianas terapéuticas, pero se necesita más investigación para explorar sus papeles funcionales en la EPOC. Este estudio proporciona evidencia transcriptómica para una comprensión más profunda de los mecanismos moleculares que subyacen al tratamiento de electroacupuntura para la EPOC.

Durante el estudio se utilizaron varios instrumentos científicos.

1. Sistema de exposición de cuerpo entero Tow-Int Tech (CSM-100C, Tow-Int Tech, Shanghai, China)

Se utiliza para exponer ratas al humo de cigarrillo para el establecimiento del modelo de rata EPOC.

Proceso de establecimiento del modelo de EPOC:

Configuración de los parámetros del equipo:

Durante el experimento, las ratas fueron colocadas en una cámara de exposición, donde fueron expuestas a un ambiente controlado de humo de cigarrillo de acuerdo con un programa específico.

Tiempo y ciclos de exposición:

El experimento duró 12 semanas, durante las cuales las ratas estuvieron expuestas al humo de los cigarrillos durante 2 horas diarias (en dos sesiones de 1 hora). En total, las ratas estuvieron expuestas al humo de 30 cigarrillos. Cada cigarrillo contenía 11 mg de alquitrán y 1,1 mg de nicotina.

Simulación del entorno patológico de la EPOC:

Al exponer a las ratas al humo de los cigarrillos durante un periodo prolongado, el modelo imitaba el proceso patológico de la EPOC causado por el tabaquismo crónico en humanos. Las sustancias nocivas del humo del tabaco indujeron inflamación crónica y estrés oxidativo en los pulmones de las ratas, lo que provocó cambios patológicos pulmonares similares a los observados en pacientes con EPOC, como daño alveolar, inflamación de las vías respiratorias pequeñas y obstrucción.

Potenciación de la respuesta inflamatoria con la inyección de LPS:

En momentos concretos (días 1, 31 y 61), se inyectó lipopolisacárido (LPS) en las ratas por vía intratraqueal. El LPS, como estimulante inflamatorio, potenció aún más la respuesta de inflamación pulmonar, haciendo que el modelo de rata se asemejara más a las características patológicas de la EPOC humana. Este enfoque ayudó a establecer un modelo animal de EPOC más estable y fiable para posteriores investigaciones sobre los efectos terapéuticos y los mecanismos de la electroacupuntura en el tratamiento de la EPOC.

2. Sistema de pruebas de la función pulmonar en animales:

El sistema se utiliza para evaluar la función pulmonar de las ratas, incluido el volumen espiratorio forzado (VEF), la capacidad vital forzada (CVF) y otros indicadores, para evaluar los efectos de la electroacupuntura (EA) en la función pulmonar de las ratas con EPOC.

Proceso de prueba de la función pulmonar:

Se anestesió a las ratas y se les practicó una traqueotomía. El sistema está equipado con un ventilador que puede controlar automáticamente el patrón respiratorio del animal, lo que permite realizar diferentes pruebas de función pulmonar.

Parámetros monitorizados:

Los parámetros evaluados incluyen el volumen espiratorio forzado en 0,1 segundos (FEV0,1), el volumen espiratorio forzado en 0,3 segundos (FEV0,3) y la capacidad vital forzada (FVC). La relación entre el VEF y la CVF (VEF/CVF) se calcula para evaluar la función pulmonar.

Estos parámetros se utilizan para evaluar el estado de la función pulmonar de las ratas, lo que ayuda a comprender los cambios de la función pulmonar en el modelo de rata con EPOC, así como el impacto de diferentes intensidades de tratamiento de electroacupuntura en la función pulmonar.

Referencia

Liu, Lu, et al. "Transcriptomic Insights into Different Stimulation Intensity of Electroacupuncture in Treating COPD in Rat Models" Journal of Inflammation Research (2024): 2873-2887.

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