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Avance innovador: Modelo murino para la evaluación rápida de la actividad de fármacos antimicobacterianos contra la tuberculosis mediante su administración por inhalación

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Un nuevo modelo murino no invasivo que utiliza M. tuberculosis autoluminiscente permite la evaluación rápida de la eficacia de los fármacos antituberculosos inhalados mediante la medición de RLU.

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Debido a las características farmacocinéticas subóptimas de las vías orales o inyectables convencionales, la eficacia de la mayoría de los compuestos contra Mycobacterium tuberculosis (MTB) suele verse limitada por una distribución y un metabolismo ineficientes del fármaco. Para mejorar las concentraciones localizadas del fármaco en los pulmones, la administración por inhalación se ha convertido en una prioridad de investigación, ya que permite la administración dirigida para elevar directamente la exposición al fármaco en los focos de infección. Sin embargo, los modelos existentes se basan predominantemente en cepas de MTB de tipo salvaje, que adolecen de complejidad operativa, plazos experimentales prolongados, elevados costes de mano de obra y escasa reproducibilidad.

En este estudio, Tian X, Gao Y, Ma W y sus colegas desarrollaron un modelo de evaluación basado en la inhalación utilizando Mycobacterium tuberculosis autoluminiscente (AIRv). Este modelo monitoriza dinámicamente la actividad del fármaco cuantificando las unidades de luz relativas (RLU) emitidas por ratones vivos infectados con la cepa autoluminiscente. El enfoque innovador ofrece las siguientes ventajas:

1. Procedimientos simplificados: Elimina la necesidad de anestesiar a los ratones, lo que simplifica la administración de fármacos y el funcionamiento de los instrumentos.
2. Rentabilidad: Sustituye los modelos de animales grandes por ratones, reduciendo significativamente los costes experimentales.
3. Plazos acelerados: Reduce el periodo de evaluación tradicional de meses a 16-17 días.
4. Evaluación no invasiva: Utiliza RLU vivas como sustitutas de las unidades formadoras de colonias (UFC), evitando el sacrificio de animales.
5. Capacidad de alto rendimiento: Permite la administración diaria simultánea a seis ratones, con un potencial de 2-3 dosis al día.
6. Mayor fiabilidad: Las mediciones objetivas de RLU minimizan la intervención humana y mejoran la reproducibilidad.

Los experimentos de prueba de concepto demostraron que la rifampicina, la isoniazida y el etambutol inhalados presentaban una potente actividad antituberculosa a bajas concentraciones (0,5, 0,5 y 0,625 mg/mL, respectivamente), y que los resultados de RLU guardaban una estrecha correlación con la eficacia terapéutica. La validación posterior confirmó una relación coherente (~10:1) entre las RLU pulmonares y las UFC, lo que refuerza las RLU como indicador fiable de la eficacia. Este método establece una plataforma eficiente y precisa para la evaluación rápida de la actividad de fármacos inhalados in vivo.

Métodos experimentales

1. Cepa y cultivo:

La cepa autoluminiscente de Mycobacterium tuberculosis (AIRv), portadora del clúster génico luxCDABE, se cultivó en caldo Middlebrook 7H9 hasta alcanzar la fase de crecimiento logarítmico (OD600 = 0,6-0,8; RLUs ≈ 5 × 10⁹/mL).

2. Establecimiento del modelo animal

2.1 Infección: Se infectaron ratones BALB/c hembra con AIRv mediante un sistema de inhalación en aerosol y se dividieron aleatoriamente en grupos (6 ratones por grupo).
2.2 Carga bacteriana inicial: El día 3 (Experimento 1) o el día 1 (Experimento 2) después de la infección, se anestesió a los ratones para la detección de RLU en el tórax. Se practicó la eutanasia a un subgrupo de ratones y se analizaron los homogeneizados pulmonares para detectar RLU y UFC (mediante placas de agar 7H10 con una incubación de 4 semanas) para evaluar los niveles de infección de referencia.

3. Administración del fármaco por inhalación

Los fármacos (rifampicina [RIF], isoniazida [INH] y etambutol [EMB]) disueltos en agua esterilizada (intervalo de dosis: 0,125-10 mg/mL) se nebulizaron y administraron diariamente mediante un dispositivo de exposición sólo nasal (Tow Systems Nose-Only). Cada sesión de tratamiento duró 20-25 minutos y se prolongó durante 14-15 días.

4. Evaluación de la eficacia

4.1 RLUs en vivo: Las RLUs se midieron de forma no invasiva en la región torácica de ratones vivos utilizando un luminómetro (GLOMAX 20/20) para la monitorización dinámica de la eficacia del fármaco.
4.2 Análisis terminal: Tras el experimento, se practicó la eutanasia a los ratones. Se cuantificaron las RLU y las UFC del homogeneizado pulmonar para validar su correlación (relación aproximada: 10:1).

5. Estudios farmacocinéticos

5.1 Toma de muestras: Se recogieron muestras de plasma y tejidos pulmonares en momentos específicos tras la inhalación. Las concentraciones del fármaco se determinaron mediante cromatografía líquida-espectrometría de masas (LC-MS).
5.2 Cálculo de parámetros: Se analizaron los parámetros farmacocinéticos, incluidos el área bajo la curva (AUC) y la semivida (t₁/₂), para evaluar la retención del fármaco y su eficacia en los tejidos pulmonares.

Resultados experimentales

1. Validación de la eficacia del modelo murino

Fuerte correlación entre RLUs y CFUs: Las unidades luminosas relativas (RLU) de Mycobacterium tuberculosis autoluminiscente (AIRv) en los pulmones mostraron una relación constante de aproximadamente 10:1 con las unidades formadoras de colonias (UFC) (p<0,0001), lo que confirma que las RLU son un marcador sustitutivo fiable para la evaluación rápida de la eficacia de los fármacos.

2. Evaluación de la actividad del fármaco

2.1 Experimento de dosis única: La rifampicina (RIF 2 mg/mL), la isoniazida (INH 2 mg/mL) y el etambutol (EMB 10 mg/mL) redujeron significativamente tanto las RLU como las UFC pulmonares en comparación con el control de disolvente (p<0,0001).

2.2 Actividad dependiente de la dosis: Rifampicina: Sólo la dosis más alta (2 mg/mL) mostró una inhibición bacteriana significativa (p<0,0001), mientras que las dosis más bajas (0,5 y 0,125 mg/mL) fueron ineficaces. Isoniazida: Tanto 2 mg/mL como 0,5 mg/mL redujeron significativamente la carga bacteriana (p<0,0001), mientras que 0,125 mg/mL no tuvieron efecto.Etambutol: Las dosis de 10 mg/mL y 2,5 mg/mL disminuyeron notablemente las RLU y las UFC (p<0,0001), mientras que la dosis más baja (0,625 mg/mL) mostró una eficacia más débil (p<0,05).


3. Propiedades farmacocinéticas

3.1 Absorción rápida: Rifampicina (2 mg/mL): La concentración plasmática máxima (16,65 ± 3,91 μg/mL) y la concentración tisular pulmonar (2,33 ± 0,89 μg/g) se alcanzaron en los 5 minutos posteriores a la inhalación. Isoniazida (0,5 mg/mL): Las concentraciones pulmonares descendieron a niveles casi indetectables en 30 minutos, lo que hizo necesarias múltiples dosis diarias. Etambutol (10 mg/mL): La concentración pulmonar máxima alcanzó 10,94 ± 1,63 μg/g, manteniendo niveles eficaces (>10 horas).

3.2 Retención prolongada:La rifampicina y el etambutol mantuvieron concentraciones eficaces en el tejido pulmonar durante 24 horas y 10 horas, respectivamente, superando significativamente sus concentraciones inhibitorias mínimas (CIM) in vitro.

Conclusión
Al integrar cepas bacterianas autoluminiscentes con la tecnología de administración por inhalación, este modelo permite una evaluación rápida y precisa de la actividad de los fármacos antituberculosos. Mejora significativamente la eficacia en el desarrollo de fármacos y proporciona un apoyo técnico fundamental para el desarrollo de nuevos regímenes terapéuticos.

Sistema de exposición por inhalación Tow-Int Tech Nose-Only

En este estudio, se utilizó el sistema de exposición por inhalación Nose-Only, propiedad de Tow-Int Tech, para administrar terapias inhaladas (por ejemplo, rifampicina) a ratones. Los resultados demostraron que este enfoque basado en la inhalación aumentaba significativamente la eficacia terapéutica en comparación con las vías orales o inyectables tradicionales, mejorando la eficiencia en el desarrollo de fármacos.

El sistema de exposición por inhalación nariz/boca está diseñado para la administración precisa de fármacos por vía oral/nasal y para experimentos de exposición por inhalación en animales de laboratorio como ratones, ratas y cobayas. Con un diseño hermético y una concentración de exposición uniforme, el sistema es ideal para estudios de inhalación con aerosoles líquidos, aerosoles de polvo, aerosoles de nanopartículas, humo y otros agentes inhalables. Garantiza una dosificación uniforme en todos los animales del mismo grupo experimental, permite la monitorización de la concentración de aerosoles y la recogida de muestras en tiempo real, e incorpora un sistema de control de alta precisión para mantener la homogeneidad y la estabilidad de la exposición.

Además, el sistema admite pruebas de diversas sustancias, incluidos productos farmacéuticos, contaminantes atmosféricos (por ejemplo, PM2,5), compuestos orgánicos, productos químicos industriales y agentes agrícolas. Admite varios protocolos experimentales, como exposición aguda/crónica, condiciones de baja/alta presión y entornos hipóxicos/hiperóxicos, lo que ofrece flexibilidad para la investigación toxicológica y farmacológica avanzada.

Referencias:
[1]Tian X, Gao Y, Ma W, et al. Establecimiento de un modelo murino no invasivo de administración por inhalación para probar rápidamente la actividad de fármacos contra Mycobacterium tuberculosis[J]. bioRxiv, 2024: 2024.02. 27.582260.
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