Optogenética y pletismografía de cuerpo entero

explorar los mecanismos de control del ritmo respiratorio

Introducción

El estudio titulado "Dbx1 Pre-Bötzinger Complex Interneurons Comprise the Core Inspiratory Oscillator for Breathing in Unanesthetized Adult Mice" de Nikolas C. Vann et al., publicado en eNeuro, investiga el mecanismo por el que las neuronas del complejo pre-Bötzinger (preBötC) derivadas de Dbx1 generan ritmos respiratorios en ratones adultos conscientes. Mediante técnicas optogenéticas, los investigadores manipularon con precisión la actividad de las neuronas Dbx1 preBötC que expresan archaerhodopsina (una proteína inhibidora sensible a la luz) o channelrhodopsina (una proteína excitadora sensible a la luz) y evaluaron el impacto en el comportamiento respiratorio.

Antecedentes de la investigación

Los movimientos respiratorios inspiratorios de los mamíferos se originan en la actividad neuronal rítmica del complejo pre-Bötzinger (preBötC) del tronco encefálico. Sin embargo, la composición neuronal precisa del preBötC sigue sin estar clara. Se cree que las neuronas derivadas de Dbx1 desempeñan un papel importante en la generación de ritmos respiratorios. Estas neuronas muestran descargas rítmicas en ratones perinatales, pero su papel en ratones adultos no se ha establecido definitivamente debido a su implicación en el control de patrones motores y funciones no respiratorias.

Métodos experimentales

Animales de experimentación

Se cruzaron ratones hembra Dbx1CreERT2, que expresan la recombinasa Cre sensible al tamoxifeno en células progenitoras derivadas de Dbx1, con ratones portadores de varios genes informadores. La expresión neuronal se indujo mediante el tratamiento con tamoxifeno, mientras que las crías de tipo salvaje sirvieron de control. Todos los experimentos fueron aprobados por el comité institucional de cuidado y uso de animales y se ajustaron a las políticas y directrices pertinentes.

Preparación y registro de cortes cerebrales

Los ratones neonatos Dbx1;ArchT fueron anestesiados mediante hipotermia y decapitados. Se prepararon cortes cerebrales que contenían el preBötC y se perfundieron en una cámara de registro con una concentración elevada de iones de potasio. Se registraron las salidas motoras inspiratorias y se utilizaron grabaciones de patch-clamp de células enteras para detectar cambios en los potenciales de membrana neuronales.

Inyección vírica e implantación de fibra óptica

Los ratones adultos Dbx1;ArchT y Dbx1;CatCh fueron anestesiados y sometidos a una craneotomía para inyectarles el virus e implantarles la fibra óptica. Los ratones Dbx1;CatCh recibieron inyecciones de virus para inducir la recombinación antes de la implantación de la fibra. Tras la recuperación, se llevaron a cabo los experimentos.

Medidas respiratorias

El comportamiento respiratorio se midió mediante pletismografía de cuerpo entero. Los ratones se sedaron ligeramente con ketotifeno o se anestesiaron brevemente con isoflurano al 2%. La respiración se evaluó midiendo las señales de flujo de aire a través de un circuito de presión y un transductor de presión diferencial.

Manipulación optogenética

Los ratones fueron expuestos a pulsos de luz de diferentes intensidades (6,8, 8,6 o 10,2 mW) y duraciones (5 segundos o 100 milisegundos) emitidos a intervalos de al menos 30 segundos. Se realizaron múltiples estimulaciones en cada ratón y se analizaron los cambios en la frecuencia respiratoria, el volumen corriente, la ventilación minuto y los efectos de reajuste de fase.

Análisis de datos

Los parámetros respiratorios se analizaron mediante un programa informático de pletismografía. Se utilizaron pruebas t pareadas y otros métodos estadísticos para comparar los parámetros en diferentes condiciones. Las curvas de respuesta de fase se trazaron agrupando y promediando los efectos de fase respiratoria de los pulsos de luz.

Examen histológico

Tras el experimento, se perfundieron y fijaron los tejidos de los animales. Las secciones cerebrales se tiñeron con NeuroTrace y se examinaron bajo microscopía de campo claro y confocal para verificar la colocación de la punta de la fibra y ajustar el contraste de la imagen.

Resultados de la investigación

Activación optogenética (ratones Dbx1;CatCh)

La estimulación luminosa del preBötC aumentó la frecuencia respiratoria tanto en estado anestesiado como despierto, pero no afectó significativamente al volumen corriente ni a la ventilación minuto. Los ratones silvestres no mostraron cambios. La estimulación luminosa de corta duración durante la fase inspiratoria prolongó el tiempo inspiratorio y retrasó las respiraciones posteriores (retraso de fase). Durante la transición inspiratorio-espiratoria o las fases espiratorias, la estimulación adelantó las respiraciones posteriores (avance de fase).

Inhibición optogenética (ratones Dbx1;ArchT)

La inhibición lumínica del preBötC redujo la frecuencia respiratoria, el volumen corriente y la ventilación minuto tanto en estado anestesiado como despierto, y una mayor intensidad lumínica produjo mayores efectos, incluido el paro respiratorio. Las crías de tipo salvaje no mostraron cambios. La inhibición lumínica de corta duración durante la inspiración temprana adelantó la siguiente inspiración (avance de fase) y acortó el tiempo inspiratorio. En la espiración temprana, retrasó la siguiente inspiración (retraso de fase).

Resultados electrofisiológicos

En rodajas de cerebro neonatal de ratón Dbx1;ArchT, la luz de 589 nm causó la hiperpolarización de las neuronas preBötC Dbx1, suprimiendo la generación de ritmo y las salidas motoras. Los efectos de la hiperpolarización fueron predominantemente postsinápticos directos y afectaron mínimamente a las neuronas no Dbx1.

Discusión

Generación de ritmos y patrones

La inhibición sostenida de la luz redujo la frecuencia respiratoria e incluso provocó un paro respiratorio, lo que indica que las neuronas Dbx1 forman parte integral del oscilador central. La reducción del volumen corriente sugiere su papel en el control del patrón motor. La estimulación lumínica sostenida aumentó significativamente la frecuencia, difiriendo de otros estudios debido a variaciones en las condiciones experimentales.

Experimentos de reajuste de fase

Tanto la activación como la inhibición de corta duración afectaron a la fase respiratoria y al tiempo inspiratorio a lo largo de los ciclos, apoyando la opinión de que las neuronas Dbx1 preBötC forman parte del generador del ritmo inspiratorio.

Exclusión de efectos no específicos

El diseño experimental descartó contribuciones de perturbaciones de entrada preBötC, terminales axonales o axones pasantes, corroborando aún más el papel de las neuronas Dbx1 preBötC en la generación del ritmo.

Papel de las células gliales

Es poco probable que las células gliales influyan en los resultados de los experimentos de inhibición. Aunque la expresión de CatCh en las células gliales podría haber contribuido a los experimentos de activación, la comparación de los efectos de ArchT y CatCh sugirió un papel neuronal dominante.

Tamaño del oscilador central

Aunque la mayoría de las neuronas Dbx1 preBötC desempeñan funciones no rítmicas, un subconjunto forma el oscilador central inspiratorio. Se necesitan estudios futuros para cuantificar la proporción de neuronas ritmogénicas no derivadas de Dbx1 y distinguir entre neuronas Dbx1 ritmogénicas y no ritmogénicas.

Conclusión

Este estudio revela que las neuronas Dbx1 preBötC influyen directamente en la frecuencia y temporización respiratorias, estableciéndolas como un componente central del oscilador inspiratorio. Estos hallazgos mejoran nuestra comprensión de la fisiología respiratoria, con implicaciones para el estudio de los trastornos respiratorios y el desarrollo de dianas terapéuticas.

Equipo utilizado en el estudio

Sistema de pletismografía de cuerpo entero

Utilizado para medir el comportamiento respiratorio en animales en movimiento libre. El sistema detecta los cambios de volumen causados por el movimiento torácico, convirtiendo las señales de presión en señales eléctricas para el análisis de la curva respiratoria y el cálculo de parámetros (por ejemplo, volumen corriente, flujo espiratorio máximo, frecuencia respiratoria).

Equipo optogenético

El láser de 589 nm (Dragon Lasers) y el láser de 473 nm (Dragon Lasers) se utilizaron para conectar las fibras ópticas de los ratones Dbx1;ArchT y Dbx1;CatCh, respectivamente, permitiendo las operaciones optogenéticas.

Sistema de pletismografía corporal Tow-Int Tech

Diseñado para realizar pruebas de la función respiratoria y la capacidad de respuesta de las vías respiratorias en animales conscientes y sin sujeción. Al combinar la optogenética con mediciones respiratorias avanzadas, el sistema facilita la investigación de los mecanismos de control del ritmo respiratorio, ofreciendo datos precisos y fiables para el estudio de condiciones fisiológicas y patológicas.

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