Breve análisis de la tecnología PCR cuantitativa por fluorescencia en tiempo real

Breve análisis de la tecnología PCR cuantitativa por fluorescencia en tiempo real

En la actualidad, según los diferentes productos químicos fluorescentes utilizados en la PCR cuantitativa fluorescente en tiempo real, la tecnología de PCR cuantitativa fluorescente se divide principalmente en dos categorías, a saber, tintes fluorescentes y sondas fluorescentes. Los colorantes fluorescentes son un método de detección no específica de secuencias amplificadas y son los primeros métodos utilizados en la PCR cuantitativa por fluorescencia. Las sondas fluorescentes son una tecnología de PCR cuantitativa por fluorescencia basada en el principio de transferencia de energía por resonancia de fluorescencia (FRET).

Colorante fluorescente

El método del colorante fluorescente también se conoce como tinción de unión al ADN. Los colorantes de unión al ADN son los primeros productos químicos utilizados en la PCR cuantitativa por fluorescencia. La principal molécula de colorante utilizada actualmente es SYBR Green I. SYBR Green I puede unirse específicamente al surco menor de las dobles cadenas de ADN. El SYBR Green I libre casi no tiene señal de fluorescencia, pero después de unirse al ADN, su señal de fluorescencia puede aumentar cientos de veces. Por lo tanto, cuantos más productos se amplifiquen por PCR, más SYBR Green Ⅰ se unirá, y más fuerte será la señal de fluorescencia [1], que puede cuantificar cualquier gen diana.

▲El principio básico de SYBR GreenⅠluminosidad

Sonda de hidrólisis

Las sondas de hidrólisis están representadas por las sondas TaqMan, también conocidas como sondas de exonucleasa. La tecnología TaqMan es un tipo de tecnología de PCR cuantitativa fluorescente en tiempo real investigada y desarrollada por la empresa estadounidense PE en 1996, y ha sido ampliamente utilizada en la detección cuantitativa de genes [2,3]. El principio básico es utilizar la actividad exonucleasa 5' de la enzima Taq, es decir, la enzima Taq tiene una actividad exonucleasa 5'-3' natural, que puede escindir nucleótidos en el extremo 5' del ADN de doble cadena y liberar un único ácido oligonucleótido.

▲Principio básico de TaqMan

▲Comparación de ventajas e inconvenientes de los métodos

Principios técnicos de los productos SpaceGen:

Tras una serie de transformaciones, la citosina (C) no metilada puede convertirse en uracilo (U). Tras la reacción PCR, el uracilo (U) se convierte finalmente en timina (T), es decir, en citosina (C) no metilada. La pirimidina (C) se convertirá finalmente en timina (T); la citosina metilada (C) no cambiará durante la reacción de modificación debido al efecto protector de su grupo metilo, es decir, la citosina metilada (C) ) se convierte en citosina (C).

Los productos de detección de metilación de SpaceGen utilizan la tecnología PAP-ARMS® para completar la detección por PCR cuantitativa fluorescente del genoma modificado, y combinan la reacción de activación por hidrólisis de pirofosfato en el principio tradicional de la tecnología ARMS. Para la detección se utilizó el método de sonda TaqMan y el proceso experimental de extracción de ácidos nucleicos-modificación de la metilación-PCR fluorescente.

Referencias

1、Proc Nat Acad Sci USA，1996，93：14509-14514.

3、Clin Chem Lab Med，1998，36：587-588.

4、Nat Genet，1993，4（3）：289-294.